有(you)些(xie)微(wei)生(sheng)物(wu)當(dang)遇(yu)到(dao)冷(leng)凍(dong)或(huo)幹(gan)燥(zao)等(deng)處(chu)理(li)時(shi)，會(hui)很(hen)快(kuai)死(si)亡(wang)，因(yin)此(ci)在(zai)這(zhe)種(zhong)情(qing)況(kuang)下(xia)，隻(zhi)能(neng)求(qiu)助(zhu)於(yu)傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)保(bao)存(cun)法(fa)。傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)就(jiu)是(shi)要(yao)定(ding)期(qi)地(di)進(jin)行(xing)菌(jun)種(zhong)轉(zhuan)接(jie)
、培pei養yang後hou再zai保bao存cun，它ta是shi最zui基ji本ben的de微wei生sheng物wu保bao存cun法fa，例li如ru酸suan奶nai等deng常chang用yong生sheng產chan菌jun種zhong的de保bao存cun。傳chuan代dai保bao存cun時shi
，培pei養yang基ji的de濃nong度du不bu宜yi過guo高gao，營ying養yang成cheng分fen不bu宜yi過guo於yu豐feng富fu
，尤you其qi是shi碳tan水shui化hua合he物wu的de濃nong度du應ying在zai可ke能neng的de範fan圍wei內nei盡jin量liang降jiang低di。培pei養yang溫wen度du通tong常chang以yi稍shao低di於yu最zui適shi生sheng長chang溫wen度du為wei好hao。若ruo為wei產chan酸suan菌jun種zhong，則ze應ying在zai培pei養yang基ji中zhong添tian加jia少shao量liang碳tan酸suan鈣gai。　　

一般地，大多數菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭氧菌
、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。傳代培養保存法雖然簡便，但其缺點也很明顯

，如：

①菌種管棉塞經常容易發黴;

②菌株的遺傳性狀容易發生變異;

③反複傳代時
，菌株的病原性、形成生理活性物質的能力以及形成孢子的能力等均有降低;

④需要定期轉種，工作量大;

⑤雜菌的汙染機會較多。

該法較前一種方法保存菌種的時間更長，適用於黴菌
、酵母菌、放(fang)線(xian)菌(jun)及(ji)需(xu)氧(yang)細(xi)菌(jun)等(deng)的(de)保(bao)存(cun)。此(ci)法(fa)可(ke)防(fang)止(zhi)幹(gan)燥(zao)，並(bing)通(tong)過(guo)限(xian)製(zhi)氧(yang)的(de)供(gong)給(gei)而(er)達(da)到(dao)削(xue)弱(ruo)微(wei)生(sheng)物(wu)代(dai)謝(xie)作(zuo)用(yong)的(de)目(mu)的(de)。其(qi)具(ju)有(you)方(fang)法(fa)簡(jian)便(bian)的(de)優(you)點(dian)，同(tong)時(shi)也(ye)適(shi)用(yong)於(yu)不(bu)宜(yi)冷(leng)凍(dong)幹(gan)燥(zao)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)(如產孢能力低的絲狀菌)的保存，而某些細菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌
、分枝杆菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷黴菌、小克銀漢黴
、毛黴、根黴等不宜采用此法進行保存。

即將微生物吸附在適當載體上進行幹燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種
，如：

①土壤保存法：zhuyaoyongyunengxingchengbaozihuobaonangdeweishengwujunzhongdebaozang。fangfashizaimiejundeturangzhongjiarujunye，lijizaishiwenxiajinxingganzaohuoshijuntifanzhihouzaiganzao，ranhoulengzanghuozaishiwenxiamifengbaocun。baocunyongdeturangyuanzeshangyifeiwodegengtuweiyi
，turangxufenggan、粉碎
、過篩和滅菌。使微生物在土壤中繁殖後進行幹燥保存的方法是：取適量土壤(5克)，置於塞有棉塞的試管中
，加水或加入充分稀釋的液體培養基(以含水量為土壤最大持水量的60%為宜)
，ranhougaoyamiejun。zaijiangxubaocundeweishengwujinxingdaliangjiezhong，peiyangzhijunsinengyongrouyanquerendechengduweizhi
，yiruganzaoqizhongjingduanshijianganzaohuofengganhoumifeng
，lengzanghuoshiwenbaocun。

②砂土保存法：取清潔的砂
，篩去掉大砂粒
，並用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液
、10%HCl溶液和水交替清洗數次，幹燥後，置於試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經幹熱滅菌後
，加入1mL菌種培養液，經充分混勻後，放入真空幹燥器中
，完全幹燥後熔封保存。也可用二份洗淨的砂(經HCl預處理)和一份貧瘠
、過篩的黃土攙和後滅菌，再進行菌種保藏。

③矽膠保存法：以6～16目的無色矽膠代替砂子
，幹熱滅菌後，加入菌液。加菌液時，由於矽膠的吸附熱常使溫度升高
，因而需設法加以冷卻。

④磁珠保存法：將菌液浸入素燒磁珠(或多孔玻璃珠)後再進行幹燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的矽膠(或無水CaSO4)，上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，經幹熱滅菌後，接入菌懸液
，最後冷藏、室溫保藏或減壓幹燥後密封保藏。本法對酵母菌很有效
，特別適用於根瘤菌，可保存長達兩年半時間。

⑤麩皮保存法：在麩皮內加入60%的水，經滅菌後接種培養
，最後幹燥保藏。

⑥紙片(濾紙)保存法：將滅菌紙片浸入培養液或菌懸液中
，常壓或減壓幹燥後
，置於裝有幹燥劑的容器內進行保存。

即使微生物混懸於適當溶液中進行保存的方法。常用的方法有：

①蒸餾水保存法：適用於黴菌、酵母菌及絕大部分放線菌，將其菌體懸浮於蒸餾水中即可在室溫下保存數年。本法應注意避免水分的蒸發。

②糖液保存法：適用於酵母菌，如將其菌體懸浮於10%的蔗糖溶液中
，然後於冷暗處保存，可長達10年。除此之外，也可使用緩衝液或食鹽水等進行保存。

即令微生物侵入其寄主後加以保存的方法。用於目前尚不能在人工培養基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞(ji)胚(pei)內(nei)感(gan)染(ran)並(bing)傳(chuan)代(dai)，此(ci)法(fa)相(xiang)當(dang)於(yu)一(yi)般(ban)微(wei)生(sheng)物(wu)的(de)傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)保(bao)藏(zang)法(fa)。病(bing)毒(du)等(deng)微(wei)生(sheng)物(wu)亦(yi)可(ke)用(yong)其(qi)他(ta)方(fang)法(fa)如(ru)液(ye)氮(dan)保(bao)藏(zang)法(fa)與(yu)冷(leng)凍(dong)幹(gan)燥(zao)保(bao)藏(zang)法(fa)進(jin)行(xing)保(bao)藏(zang)。

shiyongyukangdongliqiangdeweishengwu。zhexieweishengwukezaiqijuntixibaowaizaoshoudongjiedeqingkuangxiaerbushousunshang
，erduiqitadaduoshuweishengwueryan

，wulunzaixibaowaidongjiehaishizaixibaoneidongjie
，douhuiduijuntizaochengsunshang，dangcaiyongzhezhongbaozangfangfashi，yingzhuyiyixiajidian：

①   要選擇適於冷凍幹燥的菌齡細胞。

②   要選擇適宜的培養基

，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養基成分的變化而顯示出巨大差異。

③   要選擇合適的菌液濃度
，通常菌液濃度越高
，生存率越高

，保存期也越長。

④   最好在菌液內不添加電解質(如食鹽等)。

⑤   可在菌液內添加甘油等保護劑


，以防止在冷凍過程中出現菌體大量死亡的現象。同樣，也可添加各種糖類
、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護劑時更有效。

⑥   原則上應盡快進行冷凍處理，但當加入保護劑時，可靜置一段時間後再進行處理。

⑦   就動物細胞而言，應在-20℃範圍內以1℃/min左右的速度緩慢降溫
，此後必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多數微生物而言，則不必如此
，如結構較為複雜的原蟲則可在-35℃範圍內進行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍。

⑧   若進行長期保存，則貯藏溫度越低越好。

⑨取用冷凍保存的菌種時，應采取速融措施，即在35～40℃溫(wen)水(shui)中(zhong)輕(qing)輕(qing)振(zhen)蕩(dang)使(shi)之(zhi)迅(xun)速(su)融(rong)解(jie)。而(er)就(jiu)厭(yan)氧(yang)菌(jun)來(lai)說(shuo)，則(ze)應(ying)選(xuan)擇(ze)靜(jing)置(zhi)融(rong)化(hua)的(de)措(cuo)施(shi)。當(dang)冷(leng)凍(dong)菌(jun)融(rong)化(hua)後(hou)，應(ying)盡(jin)量(liang)避(bi)免(mian)再(zai)次(ci)冷(leng)凍(dong)，否(fou)則(ze)菌(jun)體(ti)的(de)存(cun)活(huo)率(lv)將(jiang)顯(xian)著(zhu)下(xia)降(jiang)。

常用的冷凍保存法包括：
①低溫冰箱保存法(-20℃
、-50℃或-85℃)：

低di溫wen冷leng凍dong保bao存cun時shi使shi用yong螺luo旋xuan口kou試shi管guan較jiao為wei方fang便bian
，也ye可ke在zai棉mian塞sai試shi管guan外wai包bao裹guo塑su料liao薄bo膜mo。保bao存cun時shi菌jun液ye加jia量liang不bu宜yi過guo多duo
，有you些xie可ke添tian加jia保bao護hu劑ji。此ci外wai，也ye可ke用yongφ5mm的玻璃珠來吸附菌液，然後把玻璃珠置於塑料容器內
，再放入低溫冰箱內進行保存的。

②幹冰保存法(-70℃左右)：

即將菌種管插入幹冰內
，再置於冰箱內進行冷凍保存
；

③液氮保存法(-196℃)：

是適用範圍最廣的微生物保存法。

其操作步驟如下：

a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮於含有適當防凍劑(保存黴菌不用防凍劑)的滅菌溶液中，將0.2～1mL的這種溶液分裝於安瓶中

，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或將菌絲體瓊脂塊直接懸浮於分散劑中。

b、熔封安瓶管：若直接貯存於氣相液氮中(-150℃～-170℃)時
，則不需熔封。

c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將熔封安瓶管在適當的色素溶液中浸泡2～30分鍾後

，觀察有無色素進入安瓶。

d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置於小罐中

，然後用液氮氣以約1℃/min的速度冷卻至-25℃左右，也可在-20℃～-25℃的冰箱內緩慢冷卻30～60min。

e、速冷：最後浸入液氮中快速冷卻至-196℃。

其qi原yuan理li是shi首shou先xian將jiang微wei生sheng物wu冷leng凍dong，然ran後hou在zai減jian壓ya下xia利li用yong升sheng華hua現xian象xiang除chu去qu水shui分fen。事shi實shi上shang
，從cong菌jun體ti中zhong除chu去qu大da部bu分fen水shui分fen後hou

，細xi胞bao的de生sheng理li活huo動dong就jiu會hui停ting止zhi，因yin此ci可ke以yi達da到dao長chang期qi維wei持chi生sheng命ming狀zhuang態tai的de目mu的de。該gai方fang法fa適shi用yong於yu絕jue大da多duo數shu微wei生sheng物wu菌jun種zhong(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存。在進行冷凍幹燥時，需注意以下幾個問題：　
a
、冷凍幹燥前的培養條件：首先檢驗菌種純度。一般地說
，將待保存的微生物在營養豐富且容易增菌的培養基上進行培養為宜;菌齡以達到對數生長期為好;若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以後進行保存為好;菌液濃度以高為好，如細菌應達到109～1010/mL。

b、菌株號碼等的標記：可在安瓶外側標記或在安瓶內封入標簽。

c、安瓶的準備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜
，自來水衝洗3次後

，蒸餾水刷淨，幹燥


，塞棉塞
，貼標簽，幹熱滅菌或溫熱滅菌後，60℃恒溫幹燥。

d
、添加保護劑：常用的保護劑有脫脂乳、12%蔗糖
、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等。甘油管保藏法：在5mL菌種保藏管中，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻後
，於-20℃冰箱中保存。

在5ml菌種保藏管中
，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻後，於-20℃冰箱中保存。