1、傳代保存法：youxieweishengwudangyudaolengdonghuoganzaodengchulishi
，huihenkuaisiwang
，yincizaizhezhongqingkuangxia，zhinengqiuzhuyuchuandaipeiyangbaocunfa。chuandaipeiyangjiushiyaodingqidijinxingjunzhongzhuanjie、培養後再保存，它是最基本的微生物保存法
，例如酸奶等常用生產菌種的保存。

傳chuan代dai保bao存cun時shi

，培pei養yang基ji的de濃nong度du不bu宜yi過guo高gao，營ying養yang成cheng分fen不bu宜yi過guo於yu豐feng富fu，尤you其qi是shi碳tan水shui化hua合he物wu的de濃nong度du應ying在zai可ke能neng的de範fan圍wei內nei盡jin量liang降jiang低di。培pei養yang溫wen度du通tong常chang以yi稍shao低di於yu最zui適shi生sheng長chang溫wen度du為wei好hao。若ruo為wei產chan酸suan菌jun種zhong，則ze應ying在zai培pei養yang基ji中zhong添tian加jia少shao量liang碳tan酸suan鈣gai。

一般地
，大多數菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。

傳代培養保存法雖然簡便，但其缺點也很明顯
，如：①菌種管棉塞經常容易發黴
；②菌株的遺傳性狀容易發生變異；③反複傳代時，菌株的病原性、形成生理活性物質的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期轉種

，工作量大；⑤雜菌的汙染機會較多。          

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2、液體石蠟覆蓋保存法：該法較前一種方法保存菌種的時間更長，適用於黴菌
、酵母菌、放fang線xian菌jun及ji需xu氧yang細xi菌jun等deng的de保bao存cun。此ci法fa可ke防fang止zhi幹gan燥zao，並bing通tong過guo限xian製zhi氧yang的de供gong給gei而er達da到dao削xue弱ruo微wei生sheng物wu代dai謝xie作zuo用yong的de目mu的de。其qi具ju有you方fang法fa簡jian便bian的de優you點dian，同tong時shi也ye適shi用yong於yu不bu宜yi冷leng凍dong幹gan燥zao的de微wei生sheng物wu（如產孢能力低的絲狀菌）的保存
，而某些細菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌
、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷黴菌、小克銀漢黴
、毛黴、根黴等不宜采用此法進行保存。

 

3、懸液保存法：即使微生物混懸於適當溶液中進行保存的方法。常用的有，

① 蒸餾水保存法：適用於黴菌、酵母菌及絕大部分放線菌，將其菌體懸浮於蒸餾水中即可在室溫下保存數年。本法應注意避免水分的蒸發。

② 糖液保存法：適用於酵母菌，如將其菌體懸浮於10%的蔗糖溶液中，然後於冷暗處保存


，可長達10年。除此之外，也可使用緩衝液或食鹽水等進行保存。

 

4、載體保存法：即將微生物吸附在適當載體上進行幹燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種，如

① 土壤保存法：主(zhu)要(yao)用(yong)於(yu)能(neng)形(xing)成(cheng)孢(bao)子(zi)或(huo)孢(bao)囊(nang)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)菌(jun)種(zhong)的(de)保(bao)藏(zang)。方(fang)法(fa)是(shi)在(zai)滅(mie)菌(jun)的(de)土(tu)壤(rang)中(zhong)加(jia)入(ru)菌(jun)液(ye)
，立(li)即(ji)在(zai)室(shi)溫(wen)下(xia)進(jin)行(xing)幹(gan)燥(zao)或(huo)使(shi)菌(jun)體(ti)繁(fan)殖(zhi)後(hou)再(zai)幹(gan)燥(zao)，然(ran)後(hou)冷(leng)藏(zang)或(huo)在(zai)室(shi)溫(wen)下(xia)密(mi)封(feng)保(bao)存(cun)。保(bao)存(cun)用(yong)的(de)土(tu)壤(rang)原(yuan)則(ze)上(shang)以(yi)肥(fei)沃(wo)的(de)耕(geng)土(tu)為(wei)宜(yi)，土(tu)壤(rang)需(xu)風(feng)幹(gan)、粉碎、過篩和滅菌。

使微生物在土壤中繁殖後進行幹燥保存的方法是：取適量土壤（5克）置於塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體培養基（以含水量為土壤最大持水量的60%為宜），然(ran)後(hou)高(gao)壓(ya)滅(mie)菌(jun)。再(zai)將(jiang)需(xu)保(bao)存(cun)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)進(jin)行(xing)大(da)量(liang)接(jie)種(zhong)，培(pei)養(yang)至(zhi)菌(jun)絲(si)能(neng)用(yong)肉(rou)眼(yan)確(que)認(ren)的(de)程(cheng)度(du)為(wei)止(zhi)
，移(yi)入(ru)幹(gan)燥(zao)器(qi)中(zhong)經(jing)短(duan)時(shi)間(jian)幹(gan)燥(zao)或(huo)風(feng)幹(gan)後(hou)密(mi)封(feng)
，冷(leng)藏(zang)或(huo)室(shi)溫(wen)保(bao)存(cun)。

② 砂土保存法：取清潔的砂
，過60目篩去掉大砂粒，並用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液
、10% HCl溶液和水交替清洗數次

，幹燥後，置於試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經幹熱滅菌後，加入1ml菌種培養液
，經充分混勻後，放入真空幹燥器中，完全幹燥後熔封保存。也可用二份洗淨的砂（經HCl預處理）和一份貧瘠、過篩的黃土攙和後滅菌，再進行菌種保藏。

③ 矽膠保存法：以6～16目的無色矽膠代替砂子，幹熱滅菌後，加入菌液。加菌液時，由於矽膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設法加以冷卻。

④ 磁珠保存法：將菌液浸入素燒磁珠（或多孔玻璃珠）後再進行幹燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的矽膠（或無水CaSO4），上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠
，經幹熱滅菌後，接入菌懸液，最後冷藏、室溫保藏或減壓幹燥後密封保藏。本法對酵母菌很有效，特別適用於根瘤菌，可保存長達兩年半時間。

⑤ 麩皮保存法：在麩皮內加入60%的水
，經滅菌後接種培養
，最後幹燥保藏。

⑥ 紙片（濾紙）保存法：將滅菌紙片浸入培養液或菌懸液中
，常壓或減壓幹燥後，置於裝有幹燥劑的容器內進行保存。

 

5、寄主保存法：即令微生物侵入其寄主後加以保存的方法。

 

 

6、冷凍保存法：適(shi)用(yong)於(yu)抗(kang)凍(dong)力(li)強(qiang)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)。這(zhe)些(xie)微(wei)生(sheng)物(wu)可(ke)在(zai)其(qi)菌(jun)體(ti)細(xi)胞(bao)外(wai)遭(zao)受(shou)凍(dong)結(jie)的(de)情(qing)況(kuang)下(xia)而(er)不(bu)受(shou)損(sun)傷(shang)，而(er)對(dui)其(qi)它(ta)大(da)多(duo)數(shu)微(wei)生(sheng)物(wu)而(er)言(yan)，無(wu)論(lun)在(zai)細(xi)胞(bao)外(wai)凍(dong)結(jie)還(hai)是(shi)在(zai)細(xi)胞(bao)內(nei)凍(dong)結(jie)

，都(dou)會(hui)對(dui)菌(jun)體(ti)造(zao)成(cheng)損(sun)傷(shang)，因(yin)此(ci)當(dang)采(cai)用(yong)這(zhe)種(zhong)保(bao)藏(zang)方(fang)法(fa)時(shi)，應(ying)注(zhu)意(yi)以(yi)下(xia)幾(ji)點(dian)
，

① 要選擇適於冷凍幹燥的菌齡細胞；

② 要選擇適宜的培養基，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養基成分的變化而顯示出巨大差異
；

③ 要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長；

④ 最好在菌液內不添加電解質（如食鹽等）
；

⑤ 可在菌液內添加甘油等保護劑，以防止在冷凍過程中出現菌體大量死亡的現象。同樣
，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護劑時更有效。

⑥ 原則上應盡快進行冷凍處理，但當加入保護劑時，可靜置一段時間後再進行處理。

⑦ 就動物細胞而言，應在－20℃範圍內以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此後必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多數微生物而言，則不必如此，如結構較為複雜的原蟲則可在－35℃範圍內進行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍
；

⑧ 若進行長期保存
，則貯藏溫度越低越好；

⑨ 取用冷凍保存的菌種時，應采取速融措施
，即在35～40℃溫(wen)水(shui)中(zhong)輕(qing)輕(qing)振(zhen)蕩(dang)使(shi)之(zhi)迅(xun)速(su)融(rong)解(jie)。而(er)就(jiu)厭(yan)氧(yang)菌(jun)來(lai)說(shuo)，則(ze)應(ying)選(xuan)擇(ze)靜(jing)置(zhi)融(rong)化(hua)的(de)措(cuo)施(shi)。當(dang)冷(leng)凍(dong)菌(jun)融(rong)化(hua)後(hou)，應(ying)盡(jin)量(liang)避(bi)免(mian)再(zai)次(ci)冷(leng)凍(dong)，否(fou)則(ze)菌(jun)體(ti)的(de)存(cun)活(huo)率(lv)將(jiang)顯(xian)著(zhu)下(xia)降(jiang)。

常用的冷凍保存法包括：

① 低溫冰箱保存法（－20℃

、－50℃或－85℃）：diwenlengdongbaocunshishiyongluoxuankoushiguanjiaoweifangbian，yekezaimiansaishiguanwaibaoguosuliaobomo。baocunshijunyejialiangbuyiguoduo，youxieketianjiabaohuji。ciwai，yekeyongφ5mm的玻璃珠來吸附菌液
，然後把玻璃珠置於塑料容器內
，再放入低溫冰箱內進行保存的。

② 幹冰保存法（－70℃左右）：即將菌種管插入幹冰內，再置於冰箱內進行冷凍保存。

③ 液氮保存法（－196℃）：是適用範圍最廣的微生物保存法。其操作步驟如下，

a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮於含有適當防凍劑（保存黴菌不用防凍劑）的滅菌溶液中

，將0.2～1ml的這種溶液分裝於安瓶中
，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或將菌絲體瓊脂塊直接懸浮於分散劑中。

b
、熔封安瓶管：若直接貯存於氣相液氮中（－150℃～－170℃）時，則不需熔封。

c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將熔封安瓶管在適當的色素溶液中浸泡2～30分鍾後，觀察有無色素進入安瓶。

d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置於小罐中，然後用液氮氣以約1℃/min的速度冷卻至－25℃左右，也可在－20℃～－25℃的冰箱內緩慢冷卻30～60min。

e
、速冷：最後浸入液氮中快速冷卻至－196℃。

 

7
、冷凍幹燥保存法：其原理是首先將微生物冷凍

，然後在減壓下利用升華現象除去水

分fen。事shi實shi上shang

，從cong菌jun體ti中zhong除chu去qu大da部bu分fen水shui分fen後hou
，細xi胞bao的de生sheng理li活huo動dong就jiu會hui停ting止zhi，因yin此ci可ke以yi達da到dao長chang期qi維wei持chi生sheng命ming狀zhuang態tai的de目mu的de。該gai方fang法fa適shi用yong於yu絕jue大da多duo數shu微wei生sheng物wu菌jun種zhong（包括噬菌體和立克次氏體等）的保存
，其過程如圖6-1所示。

在進行冷凍幹燥時，需注意以下幾個問題：

a
、冷凍幹燥前的培養條件：首先檢驗菌種純度。一般地說，將待保存的微生物在營養豐富且容易增菌的培養基上進行培養為宜
；菌齡以達到對數生長期為好；若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以後進行保存為好
；菌液濃度以高為好
，如細菌應達到109～1010/ml。

b
、菌株號碼等的標記：可在安瓶外側標記或在安瓶內封入標簽。

c、安瓶的準備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜，自來水衝洗3次後，蒸餾水刷淨

，幹燥
，塞棉塞，貼標簽，幹熱滅菌或溫熱滅菌後
，60℃恒溫幹燥。

d
、添加保護劑：常用的保護劑有脫脂乳
、12%蔗糖
、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等。

 

8、Bordelli氏法：取幹淨的小試管（8×60mm）塞sai上shang棉mian塞sai，滅mie菌jun。用yong滅mie菌jun的de脫tuo脂zhi牛niu乳ru洗xi脫tuo試shi管guan斜xie麵mian上shang的de菌jun苔tai，製zhi成cheng濃nong厚hou菌jun懸xuan液ye。然ran後hou用yong無wu菌jun吸xi管guan將jiang菌jun懸xuan液ye滴di入ru小xiao試shi管guan底di部bu。每mei管guan一yi滴di，然ran後hou轉zhuan動dong小xiao試shi管guan使shi菌jun液ye分fen散san在zai試shi管guan底di部bu的de壁bi上shang。標biao記ji菌jun名ming。將jiang小xiao試shi管guan裝zhuang在zai15×150mm的試管中，在大試管底部事先裝上1.5cm高的（P2O5或KOH）
，管口用帶玻璃管的橡皮塞塞緊，蠟封。將大試管與真空泵連通，抽真空至0.1～0.2mm汞柱時
，將玻璃管熔封，置室溫暗處或冰箱保存。