qishiwomenyibanweishengwushiyanshizijihaishikeyizuoyixiegongzuo，tebieshixijundejianding。zaijiushijunzhongjiandingshi，bushizhijienalaijiujianding，xuyaoyixieyuxianzuoyixiechulihuopanduan。xianjiangyixiejichuzhishijinxingzongjieruxia：

一、相關定義

1、生理生化鑒定：根據微生物對各種生理條件（溫度
、pH、氧氣
、滲透壓）、生化指標（唯1碳氮源
、抗生素
、酶
、鹽堿性）daixiefanyingjinxingfenxi
，bingjiangjieguozhuanhuachengruanjiankeyishibiedeshuju，jinxingjuleifenxi，yuyizhidecanbijunzhushujukujinxingbijiao，zuizhongduiweizhijunjinxingjiandingdeyizhongjishu。

2、革蘭氏染色：係細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，染色後細菌與環境形成鮮明對比，可以清楚地觀察到細菌的形態、排列及某些結構特征，而用以分類鑒定。

3、平板劃線法：係指把雜菌樣品通過在平板表麵劃線稀釋而獲得單菌落的方法。

4、氧化酶試驗：氧化酶不直接與氧化酶試劑起反應，而是先使細胞-色素C氧化，然後此氧化型細胞-色素C再使對苯二胺氧化
，產生顏色反應而進行的試驗，用於區分不發酵的革蘭陰性杆菌（氧化酶陽性）和腸道菌（氧化酶陰性）。

5、觸酶試驗：大多需氧和兼性厭氧菌均產生過氧化氫酶
，但鏈球菌屬陰性，故常用此試驗來鑒定，用於區分葡萄球菌(過氧化氫酶陽性）和鏈球菌(過氧化氫酶陰性）。

6、凝固酶試驗：用於區分凝固酶陰性葡萄球菌（可推測為非致病性）和凝固酶陽性葡萄球菌(很可能為致病性）。

二、工作程序

1、微生物鑒定程序

微wei生sheng物wu鑒jian定ding的de基ji本ben程cheng序xu包bao括kuo分fen離li純chun化hua和he鑒jian定ding，鑒jian定ding時shi一yi般ban先xian將jiang待dai檢jian菌jun進jin行xing初chu步bu的de分fen類lei。鑒jian定ding的de方fang法fa有you表biao型xing微wei生sheng物wu鑒jian定ding和he基ji因yin型xing微wei生sheng物wu鑒jian定ding


，根gen據ju所suo需xu要yao達da到dao的de鑒jian定ding水shui平ping選xuan擇ze鑒jian定ding方fang法fa。目mu前qian實shi驗yan室shi室shi進jin行xing表biao型xing微wei生sheng物wu鑒jian定ding後hou可ke以yi用yongAPI試劑條進行或其他等效的試劑條進行菌種鑒定，如API試劑條鑒定不能滿足要求時采取委外鑒定。

注：為了控製成本，可以自己進行鑒定，不具備能力時再委外。API鑒定用的試劑條的效期有限，需要注意效期或跟供應商做好溝通備貨。

1.1 待檢菌的分離與純化

微生物鑒定的第一步是待檢培養物的分離純化

，最chang用的分離純化方法是挑去待檢菌的純培養物（單個菌落），必要時可進一步進行純培養
，為表型鑒定和隨後的鑒定程序提供足夠量的菌體。從藥物原材料
、製藥用水、生產環境、中(zhong)間(jian)產(chan)品(pin)和(he)最(zui)終(zhong)產(chan)品(pin)的(de)樣(yang)品(pin)中(zhong)檢(jian)出(chu)的(de)受(shou)損(sun)微(wei)生(sheng)物(wu)
，經(jing)分(fen)離(li)純(chun)化(hua)程(cheng)序(xu)使(shi)其(qi)由(you)不(bu)利(li)生(sheng)存(cun)易(yi)產(chan)生(sheng)變(bian)化(hua)的(de)狀(zhuang)態(tai)變(bian)為(wei)在(zai)營(ying)養(yang)富(fu)集(ji)和(he)最(zui)佳(jia)培(pei)養(yang)溫(wen)度(du)條(tiao)件(jian)下(xia)生(sheng)存(cun)的(de)穩(wen)定(ding)狀(zhuang)態(tai)，以(yi)保(bao)證(zheng)鑒(jian)定(ding)結(jie)果(guo)的(de)準(zhun)確(que)性(xing)，具(ju)體(ti)詳(xiang)見(jian)表(biao)1。

表1待檢菌的分離與純化明細表

1.1.1 平板劃線法

平板劃線方法一般通過連續畫蛇形曲線或四區劃線方法進行。四區劃線具體步驟如下：先在平皿上做好標識
，然後在選擇所獲得的新鮮菌種進行劃線
；左手持無菌平板，拇指和食指控製皿蓋，其餘指控製皿底，打開皿蓋
，用接種環在皿上進行劃線，一區要連續緊密的幾根平行線（如果菌量過多可以更換接種環）
，二區緊著著一區的最後一根線帶出來，劃幾根平行線，然後三區、四區同樣的操作，四區應盡量避免接觸到菌落密集區，影響單菌落的形成；最後再選擇適宜的溫度進行培養。

1.1 .2 稀釋倒平板法

首先把微生物懸液作一係列的稀釋（如1:10、1:100、1:1000
、1:10000），然後分別取不同稀釋液少許，與已熔化並冷卻至50℃zuoyoudeqiongzhipeiyangjihunhe，yaoyunhou，qingrumieguojundepeiyangminzhong，daiqiongzhiningguhou


，zhichengkenenghanjundeqiongzhipingban

，baowenpeiyangyidingshijianjikechuxianjunluo。

如(ru)果(guo)稀(xi)釋(shi)得(de)當(dang)
，在(zai)平(ping)板(ban)表(biao)麵(mian)或(huo)瓊(qiong)脂(zhi)培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)就(jiu)可(ke)出(chu)現(xian)分(fen)散(san)的(de)單(dan)個(ge)菌(jun)落(luo)，這(zhe)個(ge)菌(jun)落(luo)可(ke)能(neng)就(jiu)是(shi)由(you)一(yi)個(ge)細(xi)菌(jun)細(xi)胞(bao)繁(fan)殖(zhi)形(xing)成(cheng)的(de)。隨(sui)後(hou)挑(tiao)取(qu)該(gai)單(dan)個(ge)菌(jun)落(luo)，或(huo)重(zhong)複(fu)以(yi)上(shang)操(cao)作(zuo)數(shu)次(ci)，便(bian)可(ke)得(de)到(dao)純(chun)培(pei)養(yang)。

1.1.3 塗布平板法

因(yin)為(wei)將(jiang)微(wei)生(sheng)物(wu)懸(xuan)液(ye)先(xian)加(jia)到(dao)較(jiao)燙(tang)的(de)培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)再(zai)倒(dao)平(ping)板(ban)易(yi)造(zao)成(cheng)某(mou)些(xie)熱(re)敏(min)感(gan)菌(jun)的(de)死(si)亡(wang)，且(qie)采(cai)用(yong)稀(xi)釋(shi)倒(dao)平(ping)板(ban)法(fa)也(ye)會(hui)使(shi)一(yi)些(xie)嚴(yan)格(ge)好(hao)氧(yang)菌(jun)因(yin)被(bei)固(gu)定(ding)在(zai)瓊(qiong)脂(zhi)中(zhong)間(jian)缺(que)乏(fa)氧(yang)氣(qi)而(er)影(ying)響(xiang)其(qi)生(sheng)長(chang)，因(yin)此(ci)在(zai)微(wei)生(sheng)物(wu)學(xue)研(yan)究(jiu)中(zhong)常(chang)用(yong)的(de)純(chun)種(zhong)分(fen)離(li)方(fang)法(fa)是(shi)塗(tu)布(bu)平(ping)板(ban)法(fa)。

其qi做zuo法fa是shi先xian將jiang已yi熔rong化hua的de培pei養yang基ji倒dao入ru無wu菌jun平ping皿min，製zhi成cheng無wu菌jun平ping板ban，冷leng卻que凝ning固gu後hou，將jiang一yi定ding量liang的de微wei生sheng物wu懸xuan液ye滴di加jia在zai平ping板ban表biao麵mian
，再zai用yong無wu菌jun玻bo璃li塗tu棒bang將jiang菌jun液ye均jun勻yun分fen散san至zhi整zheng個ge平ping板ban表biao麵mian，經jing培pei養yang後hou挑tiao取qu單dan個ge菌jun落luo。

1.2 初篩實驗

常規的微生物鑒定，一般要先進行初篩試驗確定待檢菌的基本微生物特征，將待檢菌進行初步分類。常見的初篩試驗包括革蘭氏染色

、芽孢染色、鏡檢觀察染色結果和細胞形態、重要的生化反應等。

1.2.1 革蘭氏染色

原理：檢查細菌細胞壁的滲透性，染色前所有細胞是透明的，結晶紫著色後用碘增加染料與菌體結合

，乙醇從G(-)菌體洗脫結晶紫

，用番紅液複染
，革蘭氏陰性菌呈粉紅色
，革蘭氏陽性菌呈藍紫色。

染色步驟：一yi般ban按an照zhao染ran色se液ye說shuo明ming書shu規gui定ding進jin行xing染ran色se，如ru說shuo明ming書shu無wu明ming確que說shuo明ming時shi按an以yi下xia步bu驟zhou進jin行xing染ran色se。結jie晶jing紫zi初chu染ran，在zai載zai玻bo片pian上shang滴di一yi小xiao滴di純chun化hua水shui，用yong灼zhuo燒shao過guo的de接jie種zhong針zhen挑tiao取qu少shao量liang細xi菌jun
，置zhi載zai玻bo片pian的de水shui滴di中zhong與yu水shui混hun合he並bing塗tu抹mo開kai
，塗tu抹mo要yao均jun勻yun平ping坦tan，塗tu抹mo後hou直zhi徑jing約yue為wei1 cm的薄層。

將jiang載zai玻bo片pian在zai火huo焰yan上shang方fang快kuai速su來lai回hui通tong過guo一yi兩liang次ci，以yi載zai玻bo片pian的de加jia熱re麵mian接jie觸chu手shou背bei皮pi膚fu
，不bu覺jiao過guo燙tang為wei佳jia，待dai冷leng卻que後hou再zai在zai火huo焰yan上shang方fang來lai回hui通tong過guo一yi兩liang次ci，再zai冷leng卻que，重zhong複fu操cao作zuo直zhi到dao薄bo層ceng幹gan燥zao為wei止zhi；在製好的片上滴一滴草酸銨結晶紫，染色1 min後用水洗；碘液媒染
，加碘液一滴，作用1 min後用水衝洗，用過濾紙吸幹；乙醇脫色，用95%乙醇脫色
，脫色時間大概為30 s。水洗後用過濾紙吸幹；番紅複染，滴加0.5%的番紅染色液一滴，染色10～30 s後，用自來水衝洗。

鏡檢：先低倍鏡，再高倍鏡
，最後油鏡觀察
，觀察菌落形態與菌落顏色，菌落呈紅色即革蘭氏陰性菌，呈藍紫色為革蘭氏陽性菌。

1.2.2 芽孢染色

yibananzhaoranseyeshiyongshuomingjinxingyabaoranse。ruwumingqueshuomingshianyixiabuzhoujinxingyabaoranse。tupian，xianzaizaibopianshangdiyidichunhuashui，yongjiezhonghuanzhuoshaoguodejiezhongzhentiaoqushaoliangxijun，zhizaibopiandeshuidizhongyushuihunhebingtumokai，tumoyaojunyunpingtan，tumohouzhijingyuewei1 cm的薄層。

幹燥固定

，將jiang載zai玻bo片pian在zai火huo焰yan上shang方fang快kuai速su來lai回hui通tong過guo一yi兩liang次ci
，以yi載zai玻bo片pian的de加jia熱re麵mian接jie觸chu手shou背bei皮pi膚fu，不bu覺jiao過guo燙tang為wei佳jia，待dai冷leng卻que後hou再zai在zai火huo焰yan上shang方fang來lai回hui通tong過guo一yi兩liang次ci，再zai冷leng卻que，重zhong複fu操cao作zuo直zhi到dao薄bo層ceng幹gan燥zao為wei止zhi。孔雀綠覆蓋，用木夾夾住載玻片一端，加數滴5%孔雀綠染液覆蓋塗片
，在微火上加熱至染料冒蒸汽並開始計時，維持5min。

衝洗，待玻片冷卻後
，用緩流自來水衝洗載玻片背麵，直至流出的水無色為止。複染，用0.5%番紅染液覆蓋玻片，保持3min。  水洗幹燥
，用緩流自來水衝洗載玻片背麵，直至流出的水無色為止，使其自然幹燥。鏡檢，觀察菌落是否含有芽孢。

1.2.3 氧化酶試驗（革蘭氏陰性杆菌）

革蘭氏陰性菌
，做氧化酶試驗。取將待檢菌落於無菌的濾紙片上，滴加一滴氧化酶試劑，反應3分鍾，出現紫色為陽性，反之為陰性。

1.2.4 非發酵菌鑒定

接種前把OF培養基在沸水浴溶解，在室溫冷卻後,每試驗分裝 2個安培的固體OF培養基，利用接種針挑單個菌落,穿刺到OF培養基(深度約1cm.)，把其中一個已接種好的安培(OF.F),用石蠟油覆蓋1cm. 把兩個安培蓋上塑料帽,培養35-37°C , 24 – 48小時。

結果判定：兩瓶均為黃色，則為發酵菌，則為發酵菌，兩管培養基一瓶顯示綠色F-，一瓶顯示黃色O+。

1.2.5 觸酶試驗（革蘭氏陽性菌）

玻片法：挑取被撿菌落於玻片上，直接用試劑進行乳化，5s內產生氣泡即為陽性結果，反之為陰性。

1.3 表型微生物鑒定

表(biao)型(xing)微(wei)生(sheng)物(wu)鑒(jian)定(ding)依(yi)據(ju)表(biao)型(xing)特(te)征(zheng)的(de)表(biao)達(da)來(lai)區(qu)分(fen)不(bu)同(tong)微(wei)生(sheng)物(wu)間(jian)的(de)差(cha)異(yi)，是(shi)經(jing)典(dian)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)分(fen)類(lei)鑒(jian)定(ding)法(fa)，以(yi)微(wei)生(sheng)物(wu)細(xi)胞(bao)的(de)形(xing)態(tai)和(he)習(xi)性(xing)表(biao)型(xing)為(wei)主(zhu)要(yao)指(zhi)標(biao)，通(tong)過(guo)比(bi)較(jiao)微(wei)生(sheng)物(wu)的(de)菌(jun)落(luo)形(xing)態(tai)、理化特征和特征化學成分與典型微生物的差異進行鑒別。微生物分類中使用的表型特征如表2。

表2 微生物分類中使用的表性特征表