其qi實shi我wo們men一yi般ban微wei生sheng物wu實shi驗yan室shi自zi己ji還hai是shi可ke以yi做zuo一yi些xie工gong作zuo，特te別bie是shi細xi菌jun的de鑒jian定ding。再zai就jiu是shi菌jun種zhong鑒jian定ding時shi，不bu是shi直zhi接jie拿na來lai就jiu鑒jian定ding，需xu要yao一yi些xie預yu先xian做zuo一yi些xie處chu理li或huo判pan斷duan。現xian將jiang一yi些xie基ji礎chu知zhi識shi進jin行xing總zong結jie如ru下xia：

一、相關定義

1
、生理生化鑒定：根據微生物對各種生理條件（溫度、pH
、氧氣
、滲透壓）
、生化指標（唯一碳氮源、抗生素

、酶
、鹽堿性）代(dai)謝(xie)反(fan)應(ying)進(jin)行(xing)分(fen)析(xi)，並(bing)將(jiang)結(jie)果(guo)轉(zhuan)化(hua)成(cheng)軟(ruan)件(jian)可(ke)以(yi)識(shi)別(bie)的(de)數(shu)據(ju)，進(jin)行(xing)聚(ju)類(lei)分(fen)析(xi)，與(yu)已(yi)知(zhi)的(de)參(can)比(bi)菌(jun)株(zhu)數(shu)據(ju)庫(ku)進(jin)行(xing)比(bi)較(jiao)
，最(zui)終(zhong)對(dui)未(wei)知(zhi)菌(jun)進(jin)行(xing)鑒(jian)定(ding)的(de)一(yi)種(zhong)技(ji)術(shu)。

2、革蘭氏染色：係細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，染色後細菌與環境形成鮮明對比，可以清楚地觀察到細菌的形態、排列及某些結構特征，而用以分類鑒定。

3
、平板劃線法：係指把雜菌樣品通過在平板表麵劃線稀釋而獲得單菌落的方法。

4、氧化酶試驗：氧化酶不直接與氧化酶試劑起反應，而是先使細胞色素C氧化，然後此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化
，產生顏色反應而進行的試驗

，用於區分不發酵的革蘭陰性杆菌（氧化酶陽性）和腸道菌（氧化酶陰性）。

5、觸酶試驗：大多需氧和兼性厭氧菌均產生過氧化氫酶，但鏈球菌屬陰性，故常用此試驗來鑒定
，用於區分葡萄球菌(過氧化氫酶陽性）和鏈球菌(過氧化氫酶陰性）。

6
、凝固酶試驗：用於區分凝固酶陰性葡萄球菌（可推測為非致病性）和凝固酶陽性葡萄球菌(很可能為致病性）。

二
、工作程序

1

、微生物鑒定程序

微wei生sheng物wu鑒jian定ding的de基ji本ben程cheng序xu包bao括kuo分fen離li純chun化hua和he鑒jian定ding，鑒jian定ding時shi一yi般ban先xian將jiang待dai檢jian菌jun進jin行xing初chu步bu的de分fen類lei。鑒jian定ding的de方fang法fa有you表biao型xing微wei生sheng物wu鑒jian定ding和he基ji因yin型xing微wei生sheng物wu鑒jian定ding
，根gen據ju所suo需xu要yao達da到dao的de鑒jian定ding水shui平ping選xuan擇ze鑒jian定ding方fang法fa。目mu前qian實shi驗yan室shi室shi進jin行xing表biao型xing微wei生sheng物wu鑒jian定ding後hou可ke以yi用yongAPI試劑條進行或其他等效的試劑條進行菌種鑒定
，如API試劑條鑒定不能滿足要求時采取委外鑒定。

注：為了控製成本，可以自己進行鑒定，不具備能力時再委外。API鑒定用的試劑條的效期有限，需要注意效期或跟供應商做好溝通備貨。

1.1 待檢菌的分離與純化

微生物鑒定的第一步是待檢培養物的分離純化，最常用的分離純化方法是挑去待檢菌的純培養物（單個菌落）
，必要時可進一步進行純培養
，為表型鑒定和隨後的鑒定程序提供足夠量的菌體。從藥物原材料
、製藥用水、生產環境、zhongjianchanpinhezuizhongchanpindeyangpinzhongjianchudeshousunweishengwu，jingfenlichunhuachengxushiqiyoubulishengcunyichanshengbianhuadezhuangtaibianweizaiyingyangfujihezuijiapeiyangwendutiaojianxiashengcundewendingzhuangtai，yibaozhengjiandingjieguodezhunquexing，jutixiangjianbiao1。

表1待檢菌的分離與純化明細表

1.1.1 平板劃線法

平板劃線方法一般通過連續畫蛇形曲線或四區劃線方法進行。四區劃線具體步驟如下：先在平皿上做好標識，然後在選擇所獲得的新鮮菌種進行劃線
；左手持無菌平板
，拇指和食指控製皿蓋，其餘指控製皿底
，打開皿蓋，用接種環在皿上進行劃線

，一區要連續緊密的幾根平行線（如果菌量過多可以更換接種環），二區緊著著一區的最後一根線帶出來
，劃幾根平行線，然後三區、四區同樣的操作，四區應盡量避免接觸到菌落密集區，影響單菌落的形成；最後再選擇適宜的溫度進行培養。

1.1 .2 稀釋倒平板法

首先把微生物懸液作一係列的稀釋（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然後分別取不同稀釋液少許，與已熔化並冷卻至50℃左(zuo)右(you)的(de)瓊(qiong)脂(zhi)培(pei)養(yang)基(ji)混(hun)合(he)，搖(yao)勻(yun)後(hou)，傾(qing)入(ru)滅(mie)過(guo)菌(jun)的(de)培(pei)養(yang)皿(min)中(zhong)，待(dai)瓊(qiong)脂(zhi)凝(ning)固(gu)後(hou)，製(zhi)成(cheng)可(ke)能(neng)含(han)菌(jun)的(de)瓊(qiong)脂(zhi)平(ping)板(ban)，保(bao)溫(wen)培(pei)養(yang)一(yi)定(ding)時(shi)間(jian)即(ji)可(ke)出(chu)現(xian)菌(jun)落(luo)。

如(ru)果(guo)稀(xi)釋(shi)得(de)當(dang)，在(zai)平(ping)板(ban)表(biao)麵(mian)或(huo)瓊(qiong)脂(zhi)培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)就(jiu)可(ke)出(chu)現(xian)分(fen)散(san)的(de)單(dan)個(ge)菌(jun)落(luo)
，這(zhe)個(ge)菌(jun)落(luo)可(ke)能(neng)就(jiu)是(shi)由(you)一(yi)個(ge)細(xi)菌(jun)細(xi)胞(bao)繁(fan)殖(zhi)形(xing)成(cheng)的(de)。隨(sui)後(hou)挑(tiao)取(qu)該(gai)單(dan)個(ge)菌(jun)落(luo)，或(huo)重(zhong)複(fu)以(yi)上(shang)操(cao)作(zuo)數(shu)次(ci)，便(bian)可(ke)得(de)到(dao)純(chun)培(pei)養(yang)。

1.1.3 塗布平板法

yinweijiangweishengwuxuanyexianjiadaojiaotangdepeiyangjizhongzaidaopingbanyizaochengmouxiereminganjundesiwang，qiecaiyongxishidaopingbanfayehuishiyixieyangehaoyangjunyinbeigudingzaiqiongzhizhongjianquefayangqieryingxiangqishengchang
，yincizaiweishengwuxueyanjiuzhongchangyongdechunzhongfenlifangfashitubupingbanfa。

其qi做zuo法fa是shi先xian將jiang已yi熔rong化hua的de培pei養yang基ji倒dao入ru無wu菌jun平ping皿min，製zhi成cheng無wu菌jun平ping板ban，冷leng卻que凝ning固gu後hou，將jiang一yi定ding量liang的de微wei生sheng物wu懸xuan液ye滴di加jia在zai平ping板ban表biao麵mian
，再zai用yong無wu菌jun玻bo璃li塗tu棒bang將jiang菌jun液ye均jun勻yun分fen散san至zhi整zheng個ge平ping板ban表biao麵mian
，經jing培pei養yang後hou挑tiao取qu單dan個ge菌jun落luo。

1.2 初篩實驗

常規的微生物鑒定，一般要先進行初篩試驗確定待檢菌的基本微生物特征
，將待檢菌進行初步分類。常見的初篩試驗包括革蘭氏染色、芽孢染色、鏡檢觀察染色結果和細胞形態

、重要的生化反應等。

1.2.1 革蘭氏染色

原理：檢查細菌細胞壁的滲透性，染色前所有細胞是透明的
，結晶紫著色後用碘增加染料與菌體結合，乙醇從G(-)菌體洗脫結晶紫，用番紅液複染，革蘭氏陰性菌呈粉紅色
，革蘭氏陽性菌呈藍紫色。

染色步驟：一(yi)般(ban)按(an)照(zhao)染(ran)色(se)液(ye)說(shuo)明(ming)書(shu)規(gui)定(ding)進(jin)行(xing)染(ran)色(se)，如(ru)說(shuo)明(ming)書(shu)無(wu)明(ming)確(que)說(shuo)明(ming)時(shi)按(an)以(yi)下(xia)步(bu)驟(zhou)進(jin)行(xing)染(ran)色(se)。結(jie)晶(jing)紫(zi)初(chu)染(ran)，在(zai)載(zai)玻(bo)片(pian)上(shang)滴(di)一(yi)小(xiao)滴(di)純(chun)化(hua)水(shui)

，用(yong)灼(zhuo)燒(shao)過(guo)的(de)接(jie)種(zhong)針(zhen)挑(tiao)取(qu)少(shao)量(liang)細(xi)菌(jun)，置(zhi)載(zai)玻(bo)片(pian)的(de)水(shui)滴(di)中(zhong)與(yu)水(shui)混(hun)合(he)並(bing)塗(tu)抹(mo)開(kai)
，塗(tu)抹(mo)要(yao)均(jun)勻(yun)平(ping)坦(tan)，塗(tu)抹(mo)後(hou)直(zhi)徑(jing)約(yue)為(wei)1 cm的薄層。

將jiang載zai玻bo片pian在zai火huo焰yan上shang方fang快kuai速su來lai回hui通tong過guo一yi兩liang次ci，以yi載zai玻bo片pian的de加jia熱re麵mian接jie觸chu手shou背bei皮pi膚fu，不bu覺jiao過guo燙tang為wei佳jia

，待dai冷leng卻que後hou再zai在zai火huo焰yan上shang方fang來lai回hui通tong過guo一yi兩liang次ci，再zai冷leng卻que，重zhong複fu操cao作zuo直zhi到dao薄bo層ceng幹gan燥zao為wei止zhi；在製好的片上滴一滴草酸銨結晶紫，染色1 min後用水洗；碘液媒染
，加碘液一滴
，作用1 min後用水衝洗，用過濾紙吸幹；乙醇脫色，用95%乙醇脫色，脫色時間大概為30 s。水洗後用過濾紙吸幹

；番紅複染，滴加0.5%的番紅染色液一滴
，染色10～30 s後
，用自來水衝洗。

鏡檢：先低倍鏡
，再高倍鏡
，最後油鏡觀察，觀察菌落形態與菌落顏色，菌落呈紅色即革蘭氏陰性菌，呈藍紫色為革蘭氏陽性菌。

1.2.2 芽孢染色

一(yi)般(ban)按(an)照(zhao)染(ran)色(se)液(ye)使(shi)用(yong)說(shuo)明(ming)進(jin)行(xing)芽(ya)孢(bao)染(ran)色(se)。如(ru)無(wu)明(ming)確(que)說(shuo)明(ming)時(shi)按(an)以(yi)下(xia)步(bu)驟(zhou)進(jin)行(xing)芽(ya)孢(bao)染(ran)色(se)。塗(tu)片(pian)，先(xian)在(zai)載(zai)玻(bo)片(pian)上(shang)滴(di)一(yi)滴(di)純(chun)化(hua)水(shui)，用(yong)接(jie)種(zhong)環(huan)灼(zhuo)燒(shao)過(guo)的(de)接(jie)種(zhong)針(zhen)挑(tiao)取(qu)少(shao)量(liang)細(xi)菌(jun)，置(zhi)載(zai)玻(bo)片(pian)的(de)水(shui)滴(di)中(zhong)與(yu)水(shui)混(hun)合(he)並(bing)塗(tu)抹(mo)開(kai)
，塗(tu)抹(mo)要(yao)均(jun)勻(yun)平(ping)坦(tan)，塗(tu)抹(mo)後(hou)直(zhi)徑(jing)約(yue)為(wei)1 cm的薄層。

幹燥固定，將jiang載zai玻bo片pian在zai火huo焰yan上shang方fang快kuai速su來lai回hui通tong過guo一yi兩liang次ci，以yi載zai玻bo片pian的de加jia熱re麵mian接jie觸chu手shou背bei皮pi膚fu，不bu覺jiao過guo燙tang為wei佳jia，待dai冷leng卻que後hou再zai在zai火huo焰yan上shang方fang來lai回hui通tong過guo一yi兩liang次ci
，再zai冷leng卻que，重zhong複fu操cao作zuo直zhi到dao薄bo層ceng幹gan燥zao為wei止zhi。孔雀綠覆蓋，用木夾夾住載玻片一端，加數滴5%孔雀綠染液覆蓋塗片，在微火上加熱至染料冒蒸汽並開始計時
，維持5min。

衝洗，待玻片冷卻後
，用緩流自來水衝洗載玻片背麵，直至流出的水無色為止。複染
，用0.5%番紅染液覆蓋玻片
，保持3min。  水洗幹燥

，用緩流自來水衝洗載玻片背麵，直至流出的水無色為止，使其自然幹燥。鏡檢，觀察菌落是否含有芽孢。

1.2.3 氧化酶試驗（革蘭氏陰性杆菌）

革蘭氏陰性菌，做氧化酶試驗。取將待檢菌落於無菌的濾紙片上，滴加一滴氧化酶試劑
，反應3分鍾
，出現紫色為陽性，反之為陰性。

1.2.4 非發酵菌鑒定

接種前把OF培養基在沸水浴溶解，在室溫冷卻後,每試驗分裝 2個安培的固體OF培養基，利用接種針挑單個菌落,穿刺到OF培養基(深度約1cm.)，把其中一個已接種好的安培(OF.F),用石蠟油覆蓋1cm. 把兩個安培蓋上塑料帽,培養35-37°C , 24 – 48小時。

結果判定：兩瓶均為黃色，則為發酵菌，則為發酵菌，兩管培養基一瓶顯示綠色F-，一瓶顯示黃色O+。

1.2.5 觸酶試驗（革蘭氏陽性菌）

玻片法：挑取被撿菌落於玻片上，直接用試劑進行乳化，5s內產生氣泡即為陽性結果，反之為陰性。

1.3 表型微生物鑒定

表biao型xing微wei生sheng物wu鑒jian定ding依yi據ju表biao型xing特te征zheng的de表biao達da來lai區qu分fen不bu同tong微wei生sheng物wu間jian的de差cha異yi

，是shi經jing典dian的de微wei生sheng物wu分fen類lei鑒jian定ding法fa，以yi微wei生sheng物wu細xi胞bao的de形xing態tai和he習xi性xing表biao型xing為wei主zhu要yao指zhi標biao
，通tong過guo比bi較jiao微wei生sheng物wu的de菌jun落luo形xing態tai、理化特征和特征化學成分與典型微生物的差異進行鑒別。微生物分類中使用的表型特征如表2。

表2 微生物分類中使用的表性特征表

1.4.API試劑條的使用

1.4.1API試劑條的選條標準

根據API係統選條標準，來選擇適合的API鑒別條來鑒別。如革蘭氏陽性球菌：觸酶試驗陽性為葡萄球菌用API STAPH鑒別，觸酶試驗陰性為鏈球菌用API 20 STREP鑒別。

1.4.2API試劑條的操作步驟

1.4.2.1分離單個菌落：用一次性無菌接種環或已滅菌棉簽挑單個可疑菌落
，盡量避免使用高度選擇性培養基。

1.4.2.2安瓿瓶的開啟：蓋上安瓿開啟器
，用手垂直握住安瓿瓶（白色塑料瓶蓋朝上），盡量將瓶蓋壓下，用大拇指頂住瓶蓋上斜麵部分
，同時用拇指向外加壓。

1.4.2.3 製菌懸液：將挑取的單個菌落置於含0.85%氯化鈉溶液或懸浮培養基5ml的安培瓶
，混勻。

1.4.2.4測定菌懸液濁度：

1.4.2.5菌液的加入：將5ml無菌水放入培養盒以提供濕潤的培養環境，同時放入試紙條，將菌液接種到小管或小管及小杯(CIT, VP和 GEL)，利用石臘油覆蓋指定的生化孔 (有劃線的孔ADH ，ODC， H2S 和URE)
，蓋上培養蓋。

1.4.2.5培養：把試紙條放進培養箱內
，利用指定溫度及時間進行培養（如API20E : 35 ~ 37℃，18-24 小時）。

1.4.2.6附加試劑加入：培養結束後
，按操作說明書規定，將附加試劑加進適當小孔內。

1.4.2.7結果分析：登錄APIWEB,試紙條上每三個小孔（小管）作為一組，記分分別為1

、2、4分
，將試紙條的顯色情況進行輸入，進行結果對比判讀。

1.4.2.8結果判讀原理：

生化結果組合跟資料庫內的典型條目(Taxa)作出比較
，經計算後，鑒定百比率（%Id）＝機會率，指示出不同菌類的比較

，T值指示出在同一個菌類的相似程度。依據T值及%Id的組合，作出評語：

極好的鑒定結果          %Id >99.9及T>0.75  
很好的鑒定結果          %Id >99.0及T>0.50  
好的鑒定結果              %Id >90.0及T>0.25  
可以接受的鑒定結果          %Id >80.0及T>0  
可疑的生化譜           N/A