​1 目的

1.1學習掌握微生物的幾種接種技術

1.2 建立無菌操作的概念，掌握無菌操作的基本環節

2 實驗說明

jiangweishengwudepeiyangwuhuohanyouweishengwudeyangpinyizhidaopeiyangjishangdecaozuojishuchengzhiweijiezhong。jiezhongshiweishengwushiyanjikexueyanjiuzhongdeyixiangzuijibendecaozuojishu。wulunweishengwudefenli、培養、chunhuahuojiandingyijiyouguanweishengwudexingtaiguanchajishengliyanjiudoubixujinxingjiezhong。jiezhongdeguanjianshiyaoyangedejinxingwujuncaozuo，rucaozuobushenyinqiwuran
，zeshiyanjieguojiubukekao，yingxiangxiayibugongzuodejinxing。

3 實驗器材

3.1 器械和用品

酒精燈
，玻璃鉛筆

，火柴，試管架、接種環
、接種針
、接種鉤、滴管
、移液管
、三角型接種棒等接種工具。

3.2 菌種和培養基

菌種：大腸杆菌（Escherichia coli），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。 培養基：普通瓊脂斜麵和平板,營養肉湯,普通瓊脂高層(直立柱)。

4 實驗流程

斜麵接種法→液體接種法→固體接種法→穿刺接種法。

5 操作步驟

5.1 斜麵接種法

斜麵接種法主要用於接種純菌
，使其增殖後用以鑒定或保存菌種。

通常先從平板培養基上挑取分離的單個菌落

，或挑取斜麵，肉湯中的純培養物接種到斜麵培養基上。操作應在無菌室、接種櫃或超淨工作台上進行
，先點燃酒精燈。

將菌種斜麵培養基(簡稱菌種管)與待接種的新鮮斜麵培養基(簡稱接種管)持在左手拇指、食指
、中指及無名指之間，菌種管在前，接種管在後，斜麵向上管口對齊，應斜持試管呈45～0度(du)角(jiao)，並(bing)能(neng)清(qing)楚(chu)地(di)看(kan)到(dao)兩(liang)個(ge)試(shi)管(guan)的(de)斜(xie)麵(mian)，注(zhu)意(yi)不(bu)要(yao)持(chi)成(cheng)水(shui)平(ping)，以(yi)免(mian)管(guan)底(di)凝(ning)集(ji)水(shui)浸(jin)濕(shi)培(pei)養(yang)基(ji)表(biao)麵(mian)。以(yi)右(you)手(shou)在(zai)火(huo)焰(yan)旁(pang)轉(zhuan)動(dong)兩(liang)管(guan)棉(mian)塞(sai)，使(shi)其(qi)鬆(song)動(dong)，以(yi)便(bian)接(jie)種(zhong)時(shi)易(yi)於(yu)取(qu)出(chu)。

右手持接種環柄，將接種環垂直放在火焰上灼燒。鎳鉻絲部分（環和絲）必(bi)須(xu)燒(shao)紅(hong)
，以(yi)達(da)到(dao)滅(mie)菌(jun)目(mu)的(de)
，然(ran)後(hou)將(jiang)除(chu)手(shou)柄(bing)部(bu)分(fen)的(de)金(jin)屬(shu)杆(gan)全(quan)用(yong)火(huo)焰(yan)灼(zhuo)燒(shao)一(yi)遍(bian)，尤(you)其(qi)是(shi)接(jie)鎳(nie)鉻(ge)絲(si)的(de)螺(luo)口(kou)部(bu)分(fen)，要(yao)徹(che)底(di)灼(zhuo)燒(shao)以(yi)免(mian)滅(mie)菌(jun)不(bu)徹(che)底(di)。用(yong)右(you)手(shou)的(de)小(xiao)指(zhi)和(he)手(shou)掌(zhang)之(zhi)間(jian)及(ji)無(wu)名(ming)指(zhi)和(he)小(xiao)指(zhi)之(zhi)間(jian)撥(bo)出(chu)試(shi)管(guan)棉(mian)塞(sai)，將(jiang)試(shi)管(guan)口(kou)在(zai)火(huo)焰(yan)上(shang)通(tong)過(guo)，以(yi)殺(sha)滅(mie)可(ke)能(neng)沾(zhan)汙(wu)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)。棉(mian)塞(sai)應(ying)始(shi)終(zhong)夾(jia)在(zai)手(shou)中(zhong)如(ru)掉(diao)落(luo)應(ying)更(geng)換(huan)無(wu)菌(jun)棉(mian)塞(sai)。

將jiang灼zhuo燒shao滅mie菌jun的de接jie種zhong環huan插cha入ru菌jun種zhong管guan內nei，先xian接jie觸chu無wu菌jun苔tai生sheng長chang的de培pei養yang基ji上shang，待dai冷leng卻que後hou再zai從cong斜xie麵mian上shang刮gua取qu少shao許xu菌jun苔tai取qu出chu

，接jie種zhong環huan不bu能neng通tong過guo火huo焰yan，應ying在zai火huo焰yan旁pang迅xun速su插cha入ru接jie種zhong管guan。在zai試shi管guan中zhong由you下xia往wang上shang做zuoSxinghuaxian。jiezhongwanbi
，jiezhonghuanyingtongguohuoyanchouchuguankou
，bingxunsusaishangmiansai。zaizhongxinzaixizhuoshaojiezhonghuanhou，fanghuiyuanchu
，bingsaijinmiansai。jiangjiezhongguantiehaobiaoqianhuoyongboliqianbihuahaobiaojihouzaifangrushiguanjia
，jikejinxingpeiyang。

5．2 液體接種法

多duo用yong於yu增zeng菌jun液ye進jin行xing增zeng菌jun培pei養yang
，也ye可ke用yong純chun培pei養yang菌jun接jie種zhong液ye體ti培pei養yang基ji進jin行xing生sheng化hua試shi驗yan
，其qi操cao作zuo方fang法fa與yu注zhu意yi事shi項xiang與yu斜xie麵mian接jie種zhong法fa基ji本ben相xiang同tong，僅jin將jiang不bu同tong點dian介jie紹shao如ru下xia：

由斜麵培養物接種至液體培養基：用yong接jie種zhong環huan從cong斜xie麵mian上shang沾zhan取qu少shao許xu菌jun苔tai
，接jie至zhi液ye體ti培pei養yang基ji時shi應ying在zai管guan內nei靠kao近jin液ye麵mian試shi管guan壁bi上shang將jiang菌jun苔tai輕qing輕qing研yan磨mo並bing輕qing輕qing振zhen蕩dang

，或huo將jiang接jie種zhong環huan在zai液ye體ti內nei振zhen搖yao幾ji次ci即ji可ke。如ru接jie種zhong黴mei菌jun菌jun種zhong時shi，若ruo用yong接jie種zhong環huan不bu易yi挑tiao起qi培pei養yang物wu時shi，可ke用yong接jie種zhong鉤gou或huo接jie種zhong鏟chan進jin行xing。

由液體培養物接種液體培養基時，可用接種環或接種針沾取少許液體移至新液體培養基即可。也可根據需要用吸管
、滴管或注射器吸取培養液移至新液體培養基即可（圖 4-5）。

接(jie)種(zhong)液(ye)體(ti)培(pei)養(yang)物(wu)時(shi)應(ying)特(te)別(bie)注(zhu)意(yi)勿(wu)使(shi)菌(jun)液(ye)濺(jian)在(zai)工(gong)作(zuo)台(tai)上(shang)或(huo)其(qi)他(ta)器(qi)皿(min)上(shang)，以(yi)免(mian)造(zao)成(cheng)汙(wu)染(ran)。如(ru)有(you)濺(jian)汙(wu)
，可(ke)用(yong)酒(jiu)精(jing)棉(mian)球(qiu)灼(zhuo)燒(shao)滅(mie)菌(jun)後(hou)，再(zai)用(yong)消(xiao)毒(du)液(ye)擦(ca)淨(jing)。凡(fan)吸(xi)過(guo)菌(jun)液(ye)的(de)吸(xi)管(guan)或(huo)滴(di)管(guan)，應(ying)立(li)即(ji)放(fang)入(ru)盛(sheng)有(you)消(xiao)毒(du)液(ye)的(de)容(rong)器(qi)內(nei)。

5.3 固體接種法

普pu通tong斜xie麵mian和he平ping板ban接jie種zhong均jun屬shu於yu固gu體ti接jie種zhong，斜xie麵mian接jie種zhong法fa已yi講jiang了le，不bu再zai贅zhui述shu。固gu體ti接jie種zhong的de另ling一yi種zhong形xing式shi是shi接jie種zhong固gu體ti曲qu料liao，進jin行xing固gu體ti發fa酵jiao。按an所suo用yong菌jun種zhong或huo種zhong子zi菌jun來lai源yuan不bu同tong可ke分fen為wei：

yongjunyejiezhonggutiliao，baokuoyongjuntaiguaxizhichengdejunxuanyehezhijiepeiyangdezhongzifajiaoye。jiezhongshianwujuncaozuojiangjunyezhijiedaorugutiliaozhong，jiaobanjunyun。danyaozhuyijiezhongsuoyongshuirongliangyaojisuanzaigutiliaozongjiashuiliangzhinei，fouzehuishijiezhonghouhanshuiliangjiada


，yingxiangpeiyangxiaoguo。

用固體種子接種固體料。包括用孢子粉、菌jun絲si孢bao子zi混hun合he種zhong子zi菌jun或huo其qi他ta固gu體ti培pei養yang的de種zhong子zi菌jun。將jiang種zhong子zi菌jun於yu無wu菌jun條tiao件jian下xia直zhi接jie倒dao入ru無wu菌jun的de固gu體ti料liao中zhong即ji可ke，但dan必bi須xu充chong分fen攪jiao拌ban使shi之zhi混hun合he均jun勻yun。一yi般ban是shi先xian把ba種zhong子zi菌jun和he少shao部bu分fen固gu體ti料liao混hun勻yun後hou再zai拌ban大da堆dui料liao。

5.4 穿刺接種法

此法多用於半固體
、醋酸鉛、三糖鐵瓊脂與明膠培養基的接種
，操作方法與注意事項與斜麵接種法基本相同。但必須使用筆直的接種針，而不能使用接種環。

接(jie)種(zhong)柱(zhu)狀(zhuang)高(gao)層(ceng)或(huo)半(ban)高(gao)層(ceng)斜(xie)麵(mian)培(pei)養(yang)管(guan)時(shi)
，應(ying)向(xiang)培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)心(xin)穿(chuan)刺(ci)，一(yi)直(zhi)插(cha)到(dao)接(jie)近(jin)管(guan)底(di)，再(zai)沿(yan)原(yuan)路(lu)抽(chou)出(chu)接(jie)種(zhong)針(zhen)。注(zhu)意(yi)勿(wu)使(shi)接(jie)種(zhong)針(zhen)在(zai)培(pei)養(yang)基(ji)內(nei)左(zuo)右(you)移(yi)動(dong)，以(yi)使(shi)穿(chuan)刺(ci)線(xian)整(zheng)齊(qi)
，便(bian)於(yu)觀(guan)察(cha)生(sheng)長(chang)結(jie)果(guo)。

6 結果

分別記錄並描繪平板劃線、斜麵和半固體接種的微生物生長情況和培養特征。

7 思考

7.1 如何確定平板上某單個菌落是否為純培養？請寫出實驗的主要步驟。

7.2 為什麼高氏I號培養基和馬丁氏培養基中要分別加入酚和鏈黴素？如果用牛肉膏蛋白腖培養基分離一種對青黴素具有抗性的細菌，你認為應如何做？

7.3 試述如何在接種中，貫徹無菌操作的原則?