所謂大腸菌群，是指在37℃培養24h 內能發酵乳糖產酸、產氣的兼性厭氧的革藍氏陰性無芽孢杆菌的總稱。主要由腸杆菌科中四個屬內的細菌組成，即埃希氏杆菌屬

、檸檬酸杆菌屬、克雷伯氏菌屬和腸杆菌屬。

水的大腸菌群數是指100 mL水檢樣內含有的大腸菌群實際數值，以大腸菌群最近似數(MPN)表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞fen鏈lian球qiu菌jun和he厭yan氧yang芽ya孢bao杆gan菌jun等deng多duo種zhong細xi菌jun。這zhe些xie細xi菌jun都dou可ke以yi隨sui人ren畜chu排pai泄xie物wu進jin入ru水shui源yuan，由you於yu大da腸chang菌jun群qun在zai腸chang道dao內nei數shu量liang多duo

，所suo以yi，水shui源yuan中zhong大da腸chang菌jun群qun的de數shu量liang，是shi直zhi接jie反fan映ying水shui源yuan被bei人ren畜chu排pai泄xie物wu汙wu染ran的de一yi項xiang重zhong要yao指zhi標biao。目mu前qian

，國guo際ji上shang已yi公gong認ren大da腸chang菌jun群qun是shi糞fen便bian汙wu染ran的de指zhi標biao。因yin而er對dui飲yin用yong水shui必bi須xu進jin行xing大da腸chang菌jun群qun的de檢jian查zha。

水(shui)中(zhong)大(da)腸(chang)菌(jun)群(qun)的(de)檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)，常(chang)用(yong)多(duo)管(guan)發(fa)酵(jiao)法(fa)和(he)濾(lv)膜(mo)法(fa)。多(duo)管(guan)發(fa)酵(jiao)法(fa)可(ke)適(shi)用(yong)於(yu)各(ge)種(zhong)水(shui)樣(yang)的(de)檢(jian)驗(yan)
，但(dan)操(cao)作(zuo)繁(fan)瑣(suo)，需(xu)要(yao)的(de)時(shi)間(jian)較(jiao)長(chang)。濾(lv)膜(mo)法(fa)僅(jin)適(shi)用(yong)於(yu)自(zi)來(lai)水(shui)和(he)深(shen)井(jing)水(shui)
，操(cao)作(zuo)簡(jian)單(dan)、快速，但不適用於雜質較多、易於堵塞濾孔的水樣。

材料與器皿

(—)培養基

1、普通乳糖蛋白腖培養液

蛋白腖 10g，牛肉膏 3g
，乳糖5g，氯化鈉 5g，1.6%溴甲酚紫乙醇液 1.0mL，蒸餾水 1000mL，pH 7.2~7.4。

將蛋白腖、牛肉膏
、乳糖、氯化鈉加熱溶解於1000mL蒸餾水中，調節pH為7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混勻
，分裝於有杜漢氏小管的試管中
，每管10mL
，115℃滅菌20min。

2、三倍濃縮乳糖蛋白腖培養液

按上述普通乳糖蛋白腖培養液濃縮三倍配製

，分裝於有杜漢氏小管的試管中，每管5mL。

3、品紅亞硫酸鈉培養基(供平板分離用)

蛋白腖 10g， 乳糖 10g
，K2HPO4 3.5g
，瓊脂 15-20g，蒸餾水1000mL，無水亞硫酸鈉 5g
，5%的堿性品紅乙醇溶液 20mL，pH 7.2~7.4。

4、伊紅美藍培養基(EMB培養基)(供發酵法平板分離用，3和4可任選一種)

蛋白腖10g
，乳糖10g
，K2HPO4 2.0g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，2%伊紅(曙紅)水溶液 20mL，5%美藍(亞甲藍)水溶液13mL，pH 7.2~7.4。

(二)滅菌移液管、滅菌稀釋水、試管、杜漢氏小管、革蘭氏染色液、滅菌培養皿。

實驗過程

(一)水樣的采集

供細菌學檢驗的水樣，必須按一般無菌操作的基本要求采集

，並保證再運送、貯存過程中不受汙染。水樣從采集到檢驗不應超過4h ，在0-4℃下保存不應超過24h ，如不能在4h內分析，應在檢驗報告上注明保存時間和條件。

1、自來水取樣：應在水龍頭打開放水5min，再用無菌容器接取水樣
，待分析。如水樣內含有餘氯
，則采樣瓶滅菌後按每500mL水樣加3% Na2S2O3.5H2O溶液1mL。

2、江、河、湖、池自然水體取樣：可用采樣器，采樣瓶應先滅菌。采樣後，瓶內應留有空隙。如果與其他化驗項目聯合取樣，細菌學分析水樣應采在其他樣品之前。

(二)初發酵試驗

1、水樣稀釋：製備水樣10-1
、10-2的稀釋液，方法為用無菌移液管吸取水樣10mL放於盛有90mL無菌水和若幹玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩使混合均勻，並使其中的細菌盡量呈單個存在
，即為10-1稀釋液;再從10-1製備10-2稀釋液。以此類推，稀釋到所需倍數。

2、接種和培養：以無菌操作於5支三倍濃縮培養基(接種前一定應先檢查杜漢氏小管內有無氣泡)中各加入水樣10mL
，5支普通培養基試管中加入水樣1mL，5支普通培養基試管中加入10-1稀釋液1mL

，小心混勻放入37℃培養箱中培養24h。此即5管法。

3
、結果觀察：37℃中培養24h後取出觀察，觀察有無氣體(杜漢氏小管內有無氣體)和酸產生(培養基有無變色)。在48h之間，培養管內倒置的杜漢氏小管內有任何量的氣體積累，或培養基顏色從紫色變為黃色，便可初步斷定為陽性反應。

若實驗所測定的15支管中均為陽性反應，說明濃水樣汙染嚴重，可將樣品進一步稀釋後
，再按上述方法接種、培養和觀察。

(三)平板培養試驗

jiangchufajiaoshiyanzhongchansuanchanqidehouzhichansuanhuozhichanqideshiguanzhongdepeiyangwuyongjiezhonghuanqushaoxu
，huaxianjiezhongzaipinhongyaliusuannapeiyangjihuoyihongmeilanpeiyangjipingbanshang，weilequebaohuodefenlidedanjunluo
，xuzhuyiyixiashixiang：

(1)劃線間距至少相隔0.5厘米;

(2)接種釘尖端要稍彎;

(3)先對試管輕擊並使之傾斜，以免接種針挑取到任何膜狀物或浮渣;

(4)劃線時要用針尖的彎曲部分接觸瓊脂培養基平麵.以免刮傷或戳破培養基。劃線後培養皿倒置，於37℃培養18-24h。

24h後(hou)
，觀(guan)察(cha)在(zai)平(ping)板(ban)上(shang)出(chu)現(xian)的(de)單(dan)個(ge)菌(jun)落(luo)
，其(qi)核(he)心(xin)有(you)深(shen)綠(lv)色(se)金(jin)屬(shu)光(guang)澤(ze)者(zhe)為(wei)較(jiao)典(dian)型(xing)的(de)大(da)腸(chang)菌(jun)群(qun)菌(jun)落(luo)。盡(jin)可(ke)能(neng)挑(tiao)取(qu)典(dian)型(xing)的(de)或(huo)接(jie)近(jin)典(dian)型(xing)的(de)大(da)腸(chang)菌(jun)群(qun)菌(jun)落(luo)
，在(zai)營(ying)養(yang)瓊(qiong)脂(zhi)斜(xie)麵(mian)上(shang)劃(hua)線(xian)，置(zhi)37℃培養24h。挑取斜麵培養物製成塗片
，進行革蘭氏染色，凡屬革蘭氏陰性杆菌，即確認了大腸菌群細菌的存在.

(四)複發酵驗證實驗

經上述經染色為革蘭氏陰性的典型菌落，用接種環刮取部分接種於盛有乳糖培養基的試管中，在37℃培養24h，陽性反應者即確認為大腸菌群細菌。

結果計算

在(zai)初(chu)發(fa)酵(jiao)試(shi)驗(yan)中(zhong)


，可(ke)能(neng)有(you)極(ji)少(shao)數(shu)能(neng)發(fa)酵(jiao)乳(ru)糖(tang)產(chan)氣(qi)的(de)非(fei)大(da)腸(chang)菌(jun)群(qun)細(xi)菌(jun)混(hun)在(zai)陽(yang)性(xing)可(ke)疑(yi)反(fan)應(ying)管(guan)中(zhong)

，通(tong)過(guo)對(dui)初(chu)發(fa)酵(jiao)中(zhong)的(de)陽(yang)性(xing)可(ke)疑(yi)管(guan)進(jin)行(xing)平(ping)板(ban)和(he)複(fu)發(fa)酵(jiao)試(shi)驗(yan)，並(bing)進(jin)行(xing)革(ge)蘭(lan)氏(shi)染(ran)色(se)和(he)細(xi)菌(jun)形(xing)態(tai)的(de)觀(guan)察(cha)，可(ke)將(jiang)那(na)些(xie)少(shao)量(liang)的(de)非(fei)大(da)腸(chang)菌(jun)群(qun)細(xi)菌(jun)(“假陽性管”)刪除去，故在記錄時隻能把三步試驗都呈陽性的試管計入陽性反應管。

如果初發酵接種水樣量為10mL
、1mL
、0.1mL，可直接查表求出原水樣100mL中大腸菌群指數(MPN)。如果接種水樣量低於上述水樣量

，則經下麵的換算式計算。