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關於高效液相首選等度洗脫，流動相比例越簡單越好，能不用緩衝鹽就不用，洗脫方法越簡單越好、色(se)譜(pu)柱(zhu)越(yue)常(chang)見(jian)越(yue)好(hao)，但(dan)是(shi)有(you)的(de)時(shi)候(hou)用(yong)單(dan)一(yi)比(bi)例(li)的(de)流(liu)動(dong)相(xiang)或(huo)者(zhe)是(shi)常(chang)見(jian)色(se)譜(pu)柱(zhu)是(shi)無(wu)法(fa)滿(man)足(zu)很(hen)多(duo)雜(za)質(zhi)的(de)分(fen)離(li)，這(zhe)時(shi)就(jiu)需(xu)重(zhong)新(xin)開(kai)發(fa)色(se)譜(pu)分(fen)離(li)方(fang)式(shi)。下(xia)麵(mian)為(wei)一(yi)些(xie)分(fen)析(xi)條(tiao)件(jian)開(kai)發(fa)的(de)個(ge)人(ren)的(de)經(jing)驗(yan)，希(xi)望(wang)給(gei)新(xin)入(ru)行(xing)的(de)朋(peng)友(you)一(yi)些(xie)實(shi)驗(yan)靈(ling)感(gan)。
01
確定目標化合物性質
首先需要明白待分離雜質的一些性質，比如說分子量、結構式（主要看有哪種基團），yijigaizhongwuzhizainazhongyoujirongjizhongyirong。jiegoushiduiyufenzijixingdaxiaodeyuceyijipandinggaiwuzhishifourongyishuijieyoufeichangzhongyaodezuoyong。liruwomenchangjiande-、-NHR、-、-COOH、-0H等都是比較常見的極性基團；而常見的苯環、-CH=、--等deng都dou是shi常chang見jian的de非fei極ji性xing基ji團tuan。根gen據ju經jing驗yan可ke以yi大da致zhi的de判pan斷duan一yi下xia物wu質zhi的de極ji性xing，預yu估gu一yi下xia在zai常chang用yong的de色se譜pu柱zhu上shang是shi否fou保bao留liu，再zai結jie合he雜za質zhi在zai各ge種zhong常chang見jian洗xi脫tuo溶rong劑ji中zhong的de溶rong解jie性xing，例li如ru在zai甲jia醇chun、乙腈、正己烷中哪個比較易溶，選擇適合用於洗脫的有機流動相，從而確定方法開發時是用正相色譜柱或者是反向色譜柱做出粗略判斷。
02
確定正反相洗脫方式
確定洗脫方式後，反向的話個人推薦先用60%的乙腈或者是甲醇，先去看一下你需要分離的幾種物質能否被分開，（正相洗脫方式思路相近）。在(zai)能(neng)分(fen)開(kai)的(de)前(qian)提(ti)下(xia)，再(zai)看(kan)一(yi)下(xia)最(zui)後(hou)一(yi)個(ge)峰(feng)的(de)出(chu)峰(feng)時(shi)間(jian)，如(ru)果(guo)時(shi)間(jian)比(bi)較(jiao)長(chang)的(de)話(hua)，再(zai)根(gen)據(ju)前(qian)幾(ji)個(ge)峰(feng)的(de)分(fen)離(li)度(du)確(que)定(ding)是(shi)否(fou)需(xu)要(yao)加(jia)大(da)或(huo)者(zhe)縮(suo)小(xiao)有(you)機(ji)相(xiang)的(de)比(bi)例(li)。我(wo)們(men)常(chang)見(jian)的(de)洗(xi)脫(tuo)分(fen)離(li)方(fang)式(shi)為(wei)反(fan)相(xiang)分(fen)離(li)，而(er)反(fan)相(xiang)洗(xi)脫(tuo)方(fang)式(shi)又(you)分(fen)為(wei)兩(liang)種(zhong)體(ti)係(xi)，一(yi)種(zhong)是(shi)甲(jia)醇(chun)-水體係，另外一種是乙腈-水體係。
具體是選擇哪種反相洗脫體係需要根據以下條件來決定：
A、乙腈的洗脫能力要優於甲醇，在同等濃度、樣品下乙腈-水體係的目標峰出峰要快於甲醇-水體係。
B、jiachunrongyushuishihuifangchureliangde，yijingrongyushuishihuixirede，zaitongdengfangshidetiduxituofangshixia，zailiangzhongliudongxianghuxianghunheshiyouyufenzireyundongdeyuanyin，jiachunrongyushuibiyijingrongyushuishidefenzireyundongjulie，zheyangliangzhongliudongxiangdehunhehuigengjiajunyun，fanyingzaijixianshangdebiaoxianweijixiangengjiadepinghua，qietidufengyaogengshao。
C、甲醇在市麵上的售價要低於乙腈（如果財大氣粗的公司可以忽略這一條）。
D、甲醇的分子量大於乙腈，在同一色譜柱、相同濃度的有機相濃度下，乙腈-水體係的柱壓更小。
E、甲醇的截止吸收波長在210nm附近，而乙腈的截止吸收波長在190nm附近，在檢測波長遠離210nm的時候選擇甲醇或是乙腈-水體係主要看其它影響因素。但是測定波長在210nm附近時，由於甲醇的截止吸收波長大於乙腈，除了流動相不同外，相同的測定條件下，乙腈-水體係測定的樣品響應值更高，從而能夠得到更小樣品檢出限，此時建議優選乙腈-水體係。
03
確定色譜柱、流速、柱溫
實驗室分析中最常用的就是類型的色譜柱，一般為5μm0.46×250mm或者是0.46×150mm，在試驗前期如果在沒有參考資料的情況下，首選最為普通的 5μm0.46×250mm的色譜柱試一下；如果發現用5μm0.46×250mm的(de)色(se)譜(pu)柱(zhu)去(qu)分(fen)離(li)多(duo)種(zhong)雜(za)質(zhi)時(shi)，有(you)分(fen)叉(cha)峰(feng)出(chu)現(xian)或(huo)是(shi)理(li)論(lun)塔(ta)板(ban)數(shu)比(bi)較(jiao)低(di)時(shi)則(ze)提(ti)示(shi)我(wo)們(men)這(zhe)種(zhong)類(lei)型(xing)的(de)色(se)譜(pu)柱(zhu)對(dui)該(gai)物(wu)質(zhi)的(de)分(fen)離(li)是(shi)不(bu)太(tai)好(hao)的(de)，需(xu)要(yao)我(wo)們(men)更(geng)換(huan)柱(zhu)效(xiao)更(geng)高(gao)的(de)色(se)譜(pu)柱(zhu)，通(tong)常(chang)選(xuan)擇(ze)粒(li)徑(jing)、填料更小的色譜柱，這個需要根據實際情況，進行試驗後確定適用於檢測的色譜柱。
而流速的選擇通常是要根據色譜柱的具體類型，最高的耐受壓力來決定，常用的色譜柱一般流速為1.0mL/min，其實流量對雜質分離的影響比較小。
柱zhu溫wen首shou選xuan室shi溫wen，柱zhu溫wen的de升sheng高gao會hui影ying響xiang雜za質zhi的de出chu峰feng快kuai慢man，理li論lun上shang柱zhu溫wen越yue高gao，各ge種zhong物wu質zhi的de出chu峰feng會hui越yue快kuai，同tong時shi色se譜pu柱zhu的de柱zhu壓ya也ye會hui越yue小xiao，但dan是shi由you於yu溫wen度du比bi較jiao高gao會hui導dao致zhi色se譜pu柱zhu中zhong填tian料liao的de健jian合he相xiang容rong易yi被bei流liu動dong相xiang衝chong刷shua下xia來lai，導dao致zhi色se譜pu柱zhu不bu可ke逆ni的de柱zhu效xiao下xia降jiang。因yin此ci色se譜pu柱zhu溫wen度du不bu宜yi過guo高gao，一yi般ban溫wen度du設she定ding為wei25~35℃，當然也有特殊的品種有的需要柱溫在40℃甚至更高。
04
梯度洗脫程序的篩選
在選擇好用正反相洗脫方式、確定用的色譜柱、柱溫、流liu速su後hou，無wu論lun如ru何he調tiao整zheng梯ti度du及ji流liu動dong相xiang比bi例li都dou無wu法fa將jiang兩liang種zhong雜za質zhi分fen離li開kai後hou，那na麼me就jiu需xu要yao用yong到dao梯ti度du洗xi脫tuo方fang式shi。梯ti度du洗xi脫tuo是shi一yi種zhong在zai不bu同tong的de時shi間jian加jia入ru不bu同tong有you機ji比bi例li流liu動dong相xiang的de一yi種zhong洗xi脫tuo方fang式shi。與yu傳chuan統tong的de等deng度du相xiang洗xi脫tuo方fang式shi比bi具ju有you以yi下xia優you點dian：
A、能(neng)夠(gou)增(zeng)加(jia)兩(liang)種(zhong)物(wu)質(zhi)的(de)分(fen)離(li)度(du)，通(tong)過(guo)不(bu)同(tong)時(shi)間(jian)段(duan)加(jia)入(ru)有(you)機(ji)相(xiang)濃(nong)度(du)的(de)不(bu)同(tong)，使(shi)雜(za)質(zhi)在(zai)不(bu)同(tong)時(shi)間(jian)段(duan)受(shou)到(dao)有(you)機(ji)相(xiang)洗(xi)脫(tuo)的(de)濃(nong)度(du)不(bu)同(tong)，一(yi)般(ban)原(yuan)則(ze)是(shi)逐(zhu)步(bu)增(zeng)加(jia)有(you)機(ji)相(xiang)的(de)比(bi)例(li)，從(cong)而(er)使(shi)難(nan)被(bei)洗(xi)脫(tuo)出(chu)來(lai)的(de)雜(za)質(zhi)加(jia)快(kuai)出(chu)峰(feng)。
B、由(you)於(yu)可(ke)以(yi)調(tiao)整(zheng)有(you)機(ji)相(xiang)加(jia)入(ru)的(de)濃(nong)度(du)，與(yu)等(deng)度(du)洗(xi)脫(tuo)相(xiang)比(bi)，可(ke)以(yi)縮(suo)短(duan)分(fen)析(xi)時(shi)間(jian)，還(hai)可(ke)以(yi)一(yi)次(ci)性(xing)將(jiang)等(deng)度(du)洗(xi)脫(tuo)分(fen)不(bu)開(kai)的(de)幾(ji)種(zhong)物(wu)質(zhi)分(fen)開(kai)，從(cong)而(er)用(yong)一(yi)種(zhong)分(fen)析(xi)方(fang)法(fa)分(fen)析(xi)多(duo)種(zhong)物(wu)質(zhi)，降(jiang)低(di)成(cheng)本(ben)。
梯度洗脫程序的摸索過程，需要遵循以下原則：
原則一：不使用單一流動相
初級實驗者梯度洗脫的時候，流動相A一般為緩衝鹽，流動相B一般為純的有機相。但是高級實驗者使用的A相往往不單純使用緩衝鹽，而是要加入一定比例的有機相，原因有兩個。
第一是加入最少5%的甲醇或者乙腈可以防止流動相長菌，減少頻繁的過濾流動相這一操作。
第二是加入一定比例的有機相可以減小在儀器進行流動相A、B相互混合時造成的基線波動，使基線更加平滑。至於流動相B到底是否是選擇純的有機相還是選擇一定比例的有機相例如（80%、90%的甲醇或乙腈）要根據實驗去做選擇。
本人推薦用一定比例的有機相為流動相B。因yin為wei在zai加jia入ru純chun的de乙yi腈jing或huo者zhe甲jia醇chun等deng有you機ji相xiang時shi，由you於yu兩liang相xiang在zai混hun合he時shi會hui有you吸xi熱re或huo放fang熱re的de反fan應ying，會hui有you很hen大da的de基ji線xian波bo動dong，用yong一yi定ding比bi例li的de有you機ji相xiang作zuo為weiB相可以有效地減小流動相衝擊效應。
原則二：有機相加入梯度梯度盡量緩
以下為筆者自己的一個實驗項目，在進行梯度方法摸索時的一個案例，
梯度方法25洗脫程序
梯度方法26洗脫程序
梯度方法27洗脫方式
梯度方法27洗脫方式
梯度洗脫程序的比較可以看出，緩慢的加入有機相可以使梯度峰更加平滑，使各雜質峰的分離度更好。
guanyutiduguifengdechuxian，ruguochundehuanchongyanxiangyuyoujirongjixiangxianghuhunheshi，huiyouhendadehurongchongjixiaoyingdechuxian，zheshihoujishianzhuangshimianshangdebijiaochangyongdeguifengbujixiaozhu，jixianyiranbushihenpinghua；suoyiwotuijianyonghunheyidingbilideyoujixiangyuyanxiangderongyezuoweihunheyanxiang，jianghunyouyidingbilishuideyoujixiangdehunheyezuoweitiduxituodeyoujixiang，peiheguifengbujixiaozhudeshiyongkeyishijixiangengjiapinghua。
05
緩衝鹽的選擇
首先要明白為什麼要加入緩衝鹽，緩衝鹽的作用之一是為了增加流動相的緩衝能力。一般常見的無機緩衝鹽（磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫氨、乙酸銨等）的作用是為了調整流動相的緩衝能力；
何為緩衝能力？緩衝能力是指在其他溶液或者物質加入到流動相後，流動相pH變化程度的大小，流動相的pH變bian化hua越yue小xiao證zheng明ming流liu動dong相xiang的de緩huan衝chong能neng力li越yue強qiang，反fan之zhi越yue弱ruo。在zai一yi些xie標biao準zhun上shang可ke以yi看kan到dao同tong一yi流liu動dong相xiang的de配pei置zhi過guo程cheng中zhong需xu要yao使shi用yong的de緩huan衝chong鹽yan有you兩liang種zhong，這zhe是shi因yin為wei使shi用yong複fu合he鹽yan作zuo為wei流liu動dong相xiang比bi使shi用yong單dan一yi的de鹽yan作zuo為wei流liu動dong相xiang的de緩huan衝chong能neng力li強qiang。有you些xie待dai測ce主zhu成cheng分fen在zai中zhong性xing或huo者zhe堿jian性xing的de環huan境jing中zhong容rong易yi水shui解jie，例li如ru帶dai-OH的基團，容易在中性、堿性環境中水解，在圖譜上表現為雙頭峰。為防止這種類型的水解，可以加入磷酸鹽用磷酸調節pH至酸性環境，從而抑製水解。
加入緩衝鹽的另外作用是為了增加待測成分的保留時間，通常帶有氨基的物質或者氨根的物質如-、-NHR、-等基團時，為了增加該物質的保留，可以添加-（硫酸基）的離子對試劑如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉，以增強保留。
一般來說緩衝鹽是不會出峰的，我曾經用pH調為3.0的水為流動相與用磷酸二氫鉀為緩衝鹽pH調為3.0deshuirongyezuoweiliudongxiang，liangzhetupuchulaidetidufengwenhedufeichanghao，suoyigeweitongrenbubidanxinhuanchongyanhuizaochengtidufeng。zaochengtidufengdezhijieyuanyinshiliudongxianghunhechongji。
06
檢測波長的選擇
guanyujiancebochangdexuanze，xuyaojieheduogezazhideziwaixishoutupuquzonghekaoliang，zuihaoxuanzeziwaixishoutezhengtupushangbofengchudebochangzuoweijiancebochang，danshiyeyaojianguqitazazhizaigaibochangxiashifouyouziwaixishou。
3個雜質的最大吸收分別為203.3、204.5、204.5nm，同時在205~230nm這個範圍內也可以作為次選波長。所以綜合考慮該三個雜質的檢測波長可以暫定為205nm。
波長選擇需要注意的點：190~210nm這(zhe)個(ge)範(fan)圍(wei)內(nei)的(de)波(bo)長(chang)慎(shen)重(zhong)選(xuan)擇(ze)，該(gai)波(bo)段(duan)的(de)波(bo)長(chang)屬(shu)於(yu)低(di)波(bo)段(duan)，受(shou)到(dao)的(de)幹(gan)擾(rao)比(bi)較(jiao)多(duo)，尤(you)其(qi)是(shi)受(shou)流(liu)動(dong)相(xiang)中(zhong)試(shi)劑(ji)的(de)純(chun)度(du)影(ying)響(xiang)較(jiao)大(da)。如(ru)果(guo)遇(yu)到(dao)試(shi)劑(ji)不(bu)純(chun)或(huo)者(zhe)水(shui)質(zhi)不(bu)好(hao)時(shi)，就(jiu)會(hui)有(you)一(yi)個(ge)類(lei)似(si)梯(ti)度(du)峰(feng)的(de)“峰”出現，此類峰往往比較平滑，並不像真正雜質的峰那樣尖銳，同時表現為無論如何調整梯度洗脫程序，始終在特定的位置“出峰”。如果該“峰”恰巧影響雜質出峰，那麼消除起來就非常難了。
筆者曾經遇到的一個項目就被這種峰糾纏了好久，後來通過更換更高級別的試劑、更純淨的水、多次衝洗儀器、色譜柱，逐步排除後才解決問題，我曾試驗過，用DAD檢測器選用265nm、225nm、205nm分別作為檢測波長，該“峰”在265nm、225nm不會出現，所以205這個波長慎重選擇。
07
溶劑的選擇
ruguoyongdengduxituo，shouxuanyongliudongxiangzuoweirongji，yibanzhijieyongliudongxiangweixishijiyijingzugoumanzurichangfenxiyaoqiu。danduiyutiduxituofangshi，zuihaoxuanzeyuchushitidunongduxiangjinrongyezuoweirongji；但是不管是等度還是梯度洗脫，都要需要考慮以下幾點：
第一是溶劑對樣品的溶解能力，如果所選的溶劑對樣品的溶解能力不足，輕則不出峰，重則堵儀器、色譜柱。
第di二er是shi需xu要yao考kao慮lv溶rong劑ji出chu峰feng是shi否fou會hui對dui目mu標biao峰feng的de分fen離li造zao成cheng影ying響xiang，如ru果guo溶rong劑ji峰feng影ying響xiang目mu標biao峰feng出chu峰feng，那na麼me所suo選xuan的de溶rong劑ji肯ken定ding是shi不bu合he適shi的de。對dui於yu梯ti度du洗xi脫tuo溶rong劑ji的de選xuan擇ze，可ke以yi通tong過guo逐zhu步bu調tiao節jie溶rong劑ji中zhong有you機ji相xiang與yu鹽yan相xiang的de比bi例li，觀guan察cha圖tu譜pu來lai選xuan擇ze合he適shi的de溶rong劑ji，同tong時shi要yao注zhu意yi溶rong劑ji的depH、緩衝能力要盡可能的與流動相相當。
我(wo)們(men)一(yi)直(zhi)說(shuo)的(de)溶(rong)劑(ji)峰(feng)到(dao)底(di)是(shi)個(ge)什(shen)麼(me)鬼(gui)？很(hen)多(duo)同(tong)仁(ren)做(zuo)了(le)很(hen)多(duo)年(nian)實(shi)驗(yan)也(ye)沒(mei)有(you)真(zhen)正(zheng)的(de)搞(gao)清(qing)楚(chu)，溶(rong)劑(ji)峰(feng)是(shi)由(you)於(yu)溶(rong)劑(ji)中(zhong)有(you)機(ji)相(xiang)與(yu)初(chu)始(shi)流(liu)動(dong)相(xiang)中(zhong)有(you)機(ji)相(xiang)的(de)不(bu)同(tong)，二(er)者(zhe)在(zai)進(jin)樣(yang)後(hou)由(you)於(yu)其(qi)極(ji)性(xing)不(bu)一(yi)樣(yang)，在(zai)同(tong)一(yi)波(bo)長(chang)下(xia)吸(xi)光(guang)度(du)不(bu)一(yi)樣(yang)而(er)導(dao)致(zhi)的(de)“出峰”，一般通過改變測定波長可以掩蔽溶劑峰的出現與否。
dangranzaishijidefenxifangfakaifazhong，henduorenjiaoderongjidexuanzebushinamezhongyao，wangwanghushirongjidezhongyaoxing。xiamianshiwozuodeyigexiangmuzhong，youyurongjixuanzebudang，yinfadeyigecanan。
不同的比例的流動相A與B混(hun)合(he)出(chu)來(lai)的(de)溶(rong)劑(ji)梯(ti)度(du)峰(feng)是(shi)有(you)差(cha)別(bie)的(de)，在(zai)前(qian)期(qi)試(shi)驗(yan)時(shi)，要(yao)盡(jin)可(ke)能(neng)多(duo)試(shi)幾(ji)種(zhong)不(bu)同(tong)濃(nong)度(du)或(huo)種(zhong)類(lei)溶(rong)劑(ji)，綜(zong)合(he)去(qu)考(kao)慮(lv)應(ying)該(gai)考(kao)慮(lv)哪(na)種(zhong)溶(rong)劑(ji)作(zuo)為(wei)最(zui)終(zhong)的(de)溶(rong)劑(ji)。
