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高效液相色譜法中的流動相主要用水性溶劑、有(you)機(ji)溶(rong)劑(ji)或(huo)它(ta)們(men)的(de)混(hun)合(he)液(ye)，水(shui)性(xing)溶(rong)劑(ji)也(ye)常(chang)用(yong)於(yu)緩(huan)衝(chong)液(ye)。常(chang)因(yin)資(zi)料(liao)上(shang)表(biao)示(shi)的(de)內(nei)容(rong)和(he)實(shi)際(ji)的(de)配(pei)製(zhi)方(fang)法(fa)不(bu)同(tong)，而(er)產(chan)生(sheng)流(liu)動(dong)相(xiang)的(de)差(cha)異(yi)，影(ying)響(xiang)了(le)色(se)譜(pu)圖(tu)和(he)分(fen)析(xi)結(jie)果(guo)。
一般來說，溶劑的混合按體積比（V/V）或重量比（W/W）jinxing。rongyedetijiyinwenduerbianhua，suoyianzhongliangbihunheketiaozhizaixianxingjiaohaodehunherongji，danyouyucaozuojiaomafan，tongchangduoyongtijibihunhe。zhiyaomeiyoutebiebiaoming，jiukeantijibijinxinghunhe，danzaiteshuqingkuangxia，ruanleizhandugaoderongyehunheshi，youshiyongzhongliang-體積比（W/V）的方法。
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
1. 流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉澱在柱中（或長時間保留在柱中）。流動相溶解度達不到要求時，盡量選用流動相中含有的比例較大的成分，以減輕進樣對流動相的影響造成基線不穩。
2. 流動相與樣品不產生化學反應，選用流動相配置對色譜峰影響最小。
3. 流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命（可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度）。
4. 流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配製。流動相組成溶劑均達不到要求時，選取的溶劑應保證在設定波長內無紫外吸收。
5. 流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。
6. 在流動相配製好後，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利於檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。
21項注意讓你更懂液相流動相
1. 選擇流動相應注意過濾溶劑
溶劑在使用前一定要用0.5μm的過濾器過濾，如果使用固體化學試劑（緩衝鹽）配製流動相，過濾特別重要，不能讓固體微粒汙染泵，阻塞進樣器和柱頭過濾片。本實驗室有水溶性和脂溶性兩種過濾膜供選擇（反光麵朝上），過濾水溶性流動相時（如甲醇/水），先用1～2mL甲醇潤濕過濾膜，有助於快速抽濾。
2. 注意保持儲液瓶的清潔
用普通溶劑瓶作流動相儲液器應不定期廢棄瓶子，最後一次應用HPLC級的水或溶劑清洗，不能在清洗過程中留下汙跡。
3. 注意保證溶劑的質量
一定要用HPLC級的溶劑，水也應達到HPLC級，同樣也要使用高純度的緩衝鹽。
4. 注意流動相脫氣不充分
流動相受熱，或者流動相不同組分混合時會有氣體產生，氣泡進入泵內引起壓力波動，增加噪音，色譜圖上出現毛刺。
可試用下列方法解決問題：
流動相再脫氣：采用更有效的脫氣方法或兩種方法配合使用；改係統內混合為係統外預混合。HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在係統內逸出氣泡，影響泵的工作。
係統中氣泡的產生：流動相本身存在，梯度淋洗混合後放出氣泡。
氣泡的影響：存在於管路中，係統壓力不穩定，實驗結果有偏差；cunzaiyudanxiangfazhong，yizaochengyetihuiliu，liuliangbuzhunque，shenzhishibuxiyecunzaiyujianceqizhong，chuxianguifeng，yingxiangjiancezhunquexing。suoyizuoyexiangduiliudongxiangdeqipaohezazhiyaoqiubijiaoyange。
氣泡會影響柱的分離效率，檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩，突然跳動）。
此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。
溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），並導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。
在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。
常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發造成的組成變化。
（1）氦氣脫氣：
氦氣脫氣是很有效的脫氣方法。氦氣緩緩的通過流動相趕去溶入的空氣，如果使用得當，在10min內可除去80%～90%的溶入氣體。由於氦氣在流動相中的溶解度極低，所以用氦氣脫氣保護的流動相可以認為是一個無氣體溶解體係。
qiquedianshihaiqijiagebijiaoanggui，huizengjiajianyanchengben。yibanshuolaiyoujirongjizhongdeqitiyituochu，ershuirongyezhongdeqitijiaowangu。zairongyezhongchuihaishixiangdangyouxiaodetuoqifangfa，zhezhonglianxutuoqifazaidianhuaxuejianceshijingchangshiyong。danhaiqianggui，nanyupuji。
（2）真空脫氣：
yeshibijiaochangyongdetuoqifangfa。xianzaiduoshuqiyedouzuichangyongzhezhongbanfa，zhuyeqibeichouchengbufenzhenkong，rongrudeqitizhengfaxingchengqipaoyichu，qixiaoguojinciyuhaiqituoqi。zaixiantuoqizhishihetuowanqizhihoudeliudongxiang，zaishiyongguochengzhongdeweiliangtuoqi。
（3）超聲波脫氣：
將配製好的流動相連容器放入超聲水槽中脫氣10～20min。這種方法比較簡便，又基本上能滿足日常分析操作的要求，所以，目前仍廣泛采用。這種方法隻能除去30%的溶解氣體，有時還會引起氣體溶解度的增加。對氧敏感的檢測器不宜用此法。
超聲脫氣比較好，10~20分鍾的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），關於超聲時間問題眾說紛紜，各實驗室內5～30分鍾不等，一般來說流動相組成為無機（緩衝鹽溶液）時，5～15分鍾即可，流動相為是水和有機容積混合時，超聲時間要相對長一些，這個方法隻能除去30%的溶解氣體，時間的延長不和效果成正比，且其中氣泡對色譜峰基線穩定性與信噪比有一定影響，一般來說影響不大，15min超聲即可足夠。
此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液麵不要高出水麵太多。
（4）加熱回流脫氣：
該方法雖然效果很好，但是適用範圍較窄。對於有機溶劑或混合流動相不適合用此法，因為揮發性組分會損失掉，改變流動相的組成。
綜(zong)合(he)來(lai)說(shuo)，用(yong)真(zhen)空(kong)抽(chou)濾(lv)後(hou)，再(zai)用(yong)超(chao)聲(sheng)脫(tuo)氣(qi)還(hai)是(shi)最(zui)常(chang)用(yong)的(de)辦(ban)法(fa)，用(yong)氦(hai)氣(qi)的(de)方(fang)法(fa)是(shi)效(xiao)果(guo)最(zui)好(hao)的(de)辦(ban)法(fa)，而(er)在(zai)線(xian)脫(tuo)氣(qi)本(ben)身(shen)也(ye)是(shi)真(zhen)空(kong)脫(tuo)氣(qi)，但(dan)它(ta)可(ke)以(yi)放(fang)到(dao)儀(yi)器(qi)上(shang)使(shi)用(yong)，是(shi)一(yi)種(zhong)保(bao)證(zheng)性(xing)的(de)辦(ban)法(fa)。
A. 離線（係統外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態，在你停止脫氣後，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內，溶劑又將被環境氣體所飽和。
B. 在線（係統內）tuoqifawuciquedian。zuichangyongdezaixiantuoqifaweigupao，jizaisepucaozuoqianhejinxingshi，jiangduoxingqitipenrurongjizhong。yangelaishuo，cifangfabunengjiangrongjituoqi，tazhishiyongyizhongdirongjiedudeduoxingqiti（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。
5. 注意流動相供給不暢
流動相用完，管道中吸入氣體引起泵壓力不穩。
應ying經jing常chang觀guan察cha儲chu液ye器qi中zhong流liu動dong相xiang的de量liang，加jia足zu流liu動dong相xiang保bao證zheng所suo有you的de樣yang品pin分fen析xi完wan畢bi。輸shu液ye管guan道dao上shang裝zhuang沉chen子zi沉chen至zhi瓶ping底di，儲chu液ye器qi蓋gai上shang留liu一yi小xiao孔kong正zheng好hao夾jia住zhu進jin液ye管guan，使shi其qi不bu能neng上shang下xia移yi動dong。
過濾器阻塞引起管道和泵腔空化，壓力不穩。
過(guo)濾(lv)器(qi)被(bei)微(wei)粒(li)所(suo)阻(zu)塞(sai)或(huo)長(chang)黴(mei)，去(qu)掉(diao)過(guo)濾(lv)器(qi)後(hou)如(ru)果(guo)係(xi)統(tong)運(yun)轉(zhuan)正(zheng)常(chang)，說(shuo)明(ming)已(yi)找(zhao)出(chu)問(wen)題(ti)，換(huan)上(shang)新(xin)的(de)過(guo)濾(lv)器(qi)則(ze)可(ke)。有(you)時(shi)候(hou)換(huan)上(shang)新(xin)的(de)過(guo)濾(lv)器(qi)仍(reng)然(ran)不(bu)暢(chang)，那(na)就(jiu)需(xu)要(yao)查(zha)查(zha)流(liu)動(dong)相(xiang)的(de)製(zhi)備(bei)過(guo)程(cheng)，或(huo)者(zhe)換(huan)大(da)孔(kong)徑(jing)的(de)過(guo)濾(lv)器(qi)。不(bu)管(guan)如(ru)何(he)，流(liu)動(dong)相(xiang)都(dou)需(xu)要(yao)重(zhong)新(xin)過(guo)濾(lv)。流(liu)速(su)過(guo)高(gao)、阻力大，造成空化現象，這是由於過濾器孔徑、管道內徑、流速和溶劑黏度等引起的。如果流速大於10mL/min，常會出現這種現象。
使用下列方法解決：
（1）使用低流速；
（2）換大孔徑的過濾器；
（3）增加進液管道內徑；
（4）抬高或加壓儲液器；
（5）不用過濾器，但流動相一定要先過濾；
（6）儲液器蓋子太緊，在儲液器內形成真空，打出的流動相不連續。應鬆開蓋子或留有1mm的縫隙；
（7）進液管道阻塞或彎曲使泵抽不到液，注意調整進液管道或更換新的。其它問題包括滲漏或接頭鬆動、泵部件損壞等，都能引起供液不正常。
6. 注意防止流動相和儲液器被汙染
youyuwuran，zaoyinyuelaiyueda，jianceqijixianshangsheng。wuranwukenengbeibengyiwendingdenongdudaruxitong，erzaiyiwendingdenongduliuchulai，suoyizaiseputuzhongbuchuduoyudefeng。yongtiduxituoshiruoliudongxiangkeyishiwuranwujuzaizhuding，liudongxiangqiangduzengjiahouwuranwukenengbeixituochulaiyigedadeweifeng。youshijixianzaoyinturanzengdahuoturantigao，doushiyinweifanfujiajinxindeliudongxianghuoxitongyongdetaijiu（通宵）所造成的。
新(xin)加(jia)進(jin)的(de)流(liu)動(dong)相(xiang)有(you)汙(wu)染(ran)物(wu)或(huo)者(zhe)流(liu)動(dong)相(xiang)長(chang)黴(mei)，繁(fan)殖(zhi)了(le)細(xi)菌(jun)。髒(zang)的(de)儲(chu)液(ye)器(qi)會(hui)汙(wu)染(ran)清(qing)潔(jie)的(de)流(liu)動(dong)相(xiang)。每(mei)種(zhong)流(liu)動(dong)相(xiang)備(bei)有(you)專(zhuan)用(yong)的(de)儲(chu)液(ye)器(qi)，或(huo)者(zhe)定(ding)期(qi)報(bao)廢(fei)儲(chu)液(ye)器(qi)。
流動相汙染來自這幾個方麵：
-
試劑質量不高，玻璃器皿不合格；
-
微生物的影響；
-
配製流動相時操作不當等。
因此要求高純度化學試劑和HPLC級溶劑。
-
要注意玻璃器皿按規定清洗幹淨；
-
為防止微生物生長，每天要用甲醇清洗係統；
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懷疑係統內生長了微生物，可用稀硝酸衝洗即可（注意不要損壞柱和管道係統）；
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真空脫氣時防止泵油帶入流動相；
-
用清潔的惰性塞子、攪棒、過濾器和玻璃器皿配製流動相；已經汙染的流動相一定要廢棄掉。
7. 注意選擇流動相應不改變填料的任何性質
低(di)交(jiao)聯(lian)度(du)的(de)離(li)子(zi)交(jiao)換(huan)樹(shu)脂(zhi)和(he)排(pai)阻(zu)色(se)譜(pu)填(tian)料(liao)有(you)時(shi)遇(yu)到(dao)某(mou)些(xie)有(you)機(ji)相(xiang)會(hui)溶(rong)脹(zhang)或(huo)收(shou)縮(suo)，從(cong)而(er)改(gai)變(bian)色(se)譜(pu)柱(zhu)填(tian)床(chuang)的(de)性(xing)質(zhi)。堿(jian)性(xing)流(liu)動(dong)相(xiang)不(bu)能(neng)用(yong)於(yu)矽(gui)膠(jiao)柱(zhu)係(xi)統(tong)。酸(suan)性(xing)流(liu)動(dong)相(xiang)不(bu)能(neng)用(yong)於(yu)氧(yang)化(hua)鋁(lv)、氧化鎂等吸附劑的柱係統。
8. 選擇流動相應注意純度
色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。
9. 選擇流動相應注意必須與檢測器匹配
使用UVjianceqishi，suoyongliudongxiangzaijiancebochangxiayingmeiyouxishou，huoxishouhenxiao。dangshiyongshichazheguangjianceqishi，yingxuanzezheguangxishuyuyangpinchabiejiaodaderongjizuoliudongxiang，yitigaolingmindu。
10. 選擇流動相應注意粘度要低（應<2cp）
高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長，最好選擇沸點在100℃以下的流動相。
11. 選擇流動相應注意對樣品的溶解度要適宜
如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉澱，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。
12. 選擇流動相應注意樣品易於回收
應選用揮發性溶劑。
13. 選擇流動相應注意由強到弱
一般先用90%的乙腈（或甲醇）/水（或緩衝溶液）進行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然後根據出峰情況調整有機溶劑（乙腈或甲醇）的比例。
14. 選擇流動相應注意三倍規則
每減少10%的有機溶劑（甲醇或乙腈）的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規則。這是一個聰明而又省力的辦法。調整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。
15. 選擇流動相應注意粗調轉微調
當分離達到一定程度，應將有機溶劑10%的改變量調整為5%，並據此規則逐漸降低調整率，直至各組分的分離情況不再改變。
16. 流動相的配製注意有機溶劑和水性溶劑的混合方法
有機溶劑和水性溶劑的混合液作為流動相是經常的，但由於混合方法不同，有時分析結果相差很大。如20mM磷酸鈉緩衝液（pH2.5）90%與乙腈10%的混合液，混合比為9∶1時，20mM磷酸鈉緩衝液（pH2.5）90%與乙腈10%的體積比為9∶1，也就是可以解釋為各自按體積比例的相當量稱取後進行混合。
另外，按10%乙腈解釋，用20mM磷酸鈉緩衝液（pH2.5），將乙腈稀釋調製也可以成立。在後者情況下，產生混合體積減少部分，餘下的添加20mM磷酸鈉緩衝液。兩者雖然沒有太大的差別，但由於混合方式不同，分析結果，特別是保留時間，也會有顯著的差別，這點必須注意。
17. 50%或（V/V＝1/1）乙腈水溶液的配製方法
對於用V/V＝1/1的表示配製乙腈水溶液，多按這種方法進行：用量筒測定乙腈500mL，用另一量筒測定水500mL，兩種液體在瓶內充分搖晃混合。不過50%乙腈水溶液的表示時，同樣也多是按上述方法配製，但查化學辭典時，實際上是按這種方法進行配製：首先將500mL乙腈，注入1L的量瓶中，量瓶邊攪拌邊加水，等待液溫達到室溫，用全量水，使溶液到1L。
這樣一來，用%表示和“V/V”tijibibiaoshi，zuizhongdechudeliudongxiangzuchengbutong。yejiushishuo，hunherongjidemidu，yuyouyuanrongjimidujisuandedanchunpingjunzhibuxiangtong，suoyiyongshangshuliangzhongfangfatiaozhideliudongxiangzuchengchayi。ruzaishiwen（25℃）附近水50mL和乙腈50mL混合時體積不是100mL，而有所減少，約為96mL。在一般情況下，多用操作簡便的第一種方法。
18. 流動相的配製注意溶劑體積的溫度影響
溶rong液ye的de密mi度du受shou周zhou圍wei溫wen度du的de影ying響xiang。剛gang從cong溶rong劑ji冷leng藏zang箱xiang拿na出chu來lai的de溶rong液ye溫wen度du與yu實shi驗yan室shi的de室shi溫wen相xiang比bi要yao低di不bu少shao，乙yi腈jing和he水shui混hun合he液ye因yin發fa熱re反fan應ying，溶rong液ye溫wen度du升sheng高gao。
因此，為能調製再現性好的流動相，建議在使用前用恒溫水浴鍋將液溫調到接近室溫。
19. 流動相的配製注意用兩台泵進行溶劑混合
雙shuang泵beng主zhu要yao是shi在zai探tan討tao流liu動dong相xiang的de配pei比bi或huo者zhe梯ti度du洗xi脫tuo是shi比bi較jiao方fang便bian，知zhi道dao確que切qie的de液ye相xiang色se譜pu儀yi條tiao件jian時shi，建jian議yi配pei好hao後hou使shi用yong的de話hua，混hun合he比bi較jiao均jun勻yun，效xiao果guo較jiao好hao。在zai反fan相xiang分fen析xi中zhong，常chang用yong的de有you機ji溶rong劑ji和he水shui的de等deng濃nong度du法fa，使shi用yong高gao壓ya兩liang元yuan梯ti度du係xi統tong，用yong兩liang台tai泵beng將jiang流liu動dong相xiang分fen別bie輸shu液ye後hou混hun合he等deng封feng閉bi式shi混hun合he時shi與yu預yu先xian在zai瓶ping內nei混hun合he後hou用yong1台泵輸液時，因混合後體積變化的不同，保留時間也有所不同，一定要注意。
不僅是流動性的調製方法，試樣溶液和其他溶液的調製也經常有上述問題，另外，在不同部門（醫藥部門或化工部門）各(ge)自(zi)都(dou)有(you)自(zi)己(ji)的(de)常(chang)識(shi)和(he)習(xi)慣(guan)。在(zai)這(zhe)種(zhong)情(qing)況(kuang)下(xia)，就(jiu)要(yao)求(qiu)各(ge)部(bu)門(men)在(zai)製(zhi)作(zuo)相(xiang)關(guan)溶(rong)液(ye)配(pei)製(zhi)方(fang)法(fa)時(shi)能(neng)規(gui)定(ding)通(tong)則(ze)，定(ding)義(yi)設(she)計(ji)溶(rong)液(ye)的(de)調(tiao)製(zhi)方(fang)法(fa)，這(zhe)樣(yang)避(bi)免(mian)混(hun)亂(luan)，以(yi)在(zai)日(ri)常(chang)工(gong)作(zuo)中(zhong)更(geng)好(hao)地(di)記(ji)住(zhu)這(zhe)些(xie)表(biao)示(shi)方(fang)法(fa)。
20. 注意流動相的pH
如需在一定PH值下操作，須定期測定流動相的PH值，大氣中的CO2溶解在流動相內將引起PH值的改變，特別是貯液瓶密閉不嚴時這種影響可能更大。
21. 注意更換柱子及流動相
軟質或半軟質填料的溶脹率隨溶劑極性的變化而變化，使用新柱時應先用25~30倍柱容積的合適流動相平衡。更換流動相時，如果兩種流動相不互溶，需采用過渡溶劑使前一種流動相逐步溶解除去。例如，2、2、4-三甲基戊烷換成甲醇時，必須用乙酸已酯或其他溶劑過渡，直到標準物保留值達到穩定狀態。
