一


、抗血清的製備

　　有了質量好的抗原，還必須選擇適當的免疫途徑，才能產生質量好（特異性強和效價高）的抗體。

　　（一）用於免疫的動物

　　作免疫用的動物有哺乳類和禽類
，主要為羊
、馬


、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實驗室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動物種類的選擇主要根據抗原的生物學特性和所要獲得抗血清數量，如一般製備抗r-免mian疫yi球qiu蛋dan白bai抗kang血xue清qing，多duo用yong家jia兔tu和he山shan羊yang
，因yin動dong物wu反fan應ying良liang好hao，而er且qie能neng夠gou提ti供gong足zu夠gou數shu量liang的de血xue清qing

，用yong於yu免mian疫yi的de動dong物wu應ying適shi齡ling
，健jian壯zhuang
，無wu感gan染ran性xing疾ji患huan，最zui好hao為wei///雄(xiong)性(xing)，此(ci)外(wai)還(hai)需(xu)十(shi)分(fen)注(zhu)意(yi)動(dong)物(wu)的(de)飼(si)養(yang)，以(yi)消(xiao)除(chu)動(dong)物(wu)的(de)個(ge)體(ti)差(cha)異(yi)以(yi)及(ji)在(zai)免(mian)疫(yi)過(guo)程(cheng)中(zhong)死(si)亡(wang)的(de)影(ying)響(xiang)。若(ruo)用(yong)兔(tu)
，最(zui)好(hao)用(yong)純(chun)種(zhong)新(xin)西(xi)蘭(lan)兔(tu)，一(yi)組(zu)三(san)隻(zhi)，兔(tu)的(de)體(ti)重(zhong)以(yi)2～3kg為宜。

　　（二）免疫途徑

　　免疫途徑有多種多樣
，如靜脈內、腹腔內、肌肉內、皮內
、皮下、淋巴結內注射等，一般常用皮下或背部多點皮內注射
，每點注射0.1ml左右。途徑的選擇決定於抗原的生物學特性和理化特性
，如激素
、酶
、毒素等生物學活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。

　　（三）佐劑

　　由(you)於(yu)不(bu)同(tong)個(ge)體(ti)對(dui)同(tong)一(yi)抗(kang)原(yuan)的(de)反(fan)應(ying)性(xing)不(bu)同(tong)
，而(er)且(qie)不(bu)同(tong)抗(kang)原(yuan)產(chan)生(sheng)免(mian)疫(yi)反(fan)應(ying)的(de)能(neng)力(li)也(ye)有(you)強(qiang)有(you)弱(ruo)，因(yin)此(ci)常(chang)常(chang)在(zai)注(zhu)射(she)抗(kang)原(yuan)的(de)同(tong)時(shi)
，加(jia)入(ru)能(neng)增(zeng)強(qiang)抗(kang)原(yuan)的(de)抗(kang)原(yuan)性(xing)物(wu)質(zhi)

，以(yi)刺(ci)激(ji)機(ji)體(ti)產(chan)生(sheng)較(jiao)強(qiang)的(de)免(mian)疫(yi)反(fan)應(ying)

，這(zhe)種(zhong)物(wu)質(zhi)稱(cheng)為(wei)免(mian)疫(yi)佐(zuo)劑(ji)。

　　佐(zuo)劑(ji)除(chu)了(le)延(yan)長(chang)抗(kang)原(yuan)在(zai)體(ti)內(nei)的(de)存(cun)留(liu)時(shi)間(jian)，增(zeng)加(jia)抗(kang)原(yuan)刺(ci)激(ji)作(zuo)用(yong)外(wai)，更(geng)主(zhu)要(yao)的(de)是(shi)，它(ta)能(neng)刺(ci)激(ji)網(wang)狀(zhuang)內(nei)皮(pi)係(xi)統(tong)

，使(shi)參(can)與(yu)免(mian)疫(yi)反(fan)應(ying)的(de)免(mian)疫(yi)活(huo)性(xing)細(xi)胞(bao)增(zeng)多(duo)
，促(cu)進(jin)T細胞與B細胞的相互作用
，從而增強機體對抗原的細胞免疫和抗體的產生。

　　常用的佐劑是福氏佐劑（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份
，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調整為1：2～9（V/V），這是不完全福氏佐劑

，在每毫升不完全佐劑加入1～20mg卡介苗就成為完全佐劑。

　　配製方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4℃xiabaocunbeiyong。mianyiqianqudengrongjiwanquanhuobuwanquanzuojiyumianyiyuanrongyehunhe

，yongzhendangqihunyunchengruzhuang
，yekeyizaimianyiqianquxuyaoliangzuojizhirubozhongyanmo，junyunhouzaibianmobiandijiarudengrongjikangyuanye（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完後再繼續研磨成乳劑，滴於冰水上5～10min內(nei)完(wan)全(quan)不(bu)擴(kuo)散(san)為(wei)止(zhi)。為(wei)避(bi)免(mian)損(sun)失(shi)抗(kang)原(yuan)，亦(yi)可(ke)用(yong)一(yi)注(zhu)射(she)器(qi)裝(zhuang)抗(kang)原(yuan)液(ye)，另(ling)一(yi)注(zhu)射(she)器(qi)裝(zhuang)佐(zuo)劑(ji)
，二(er)者(zhe)以(yi)聚(ju)乙(yi)烯(xi)塑(su)料(liao)管(guan)連(lian)接(jie)，然(ran)後(hou)二(er)者(zhe)來(lai)回(hui)反(fan)複(fu)抽(chou)吸(xi)
，約(yue)數(shu)十(shi)分(fen)鍾(zhong)後(hou)即(ji)能(neng)完(wan)全(quan)乳(ru)化(hua)。檢(jian)查(zha)合(he)格(ge)後(hou)即(ji)以(yi)其(qi)中(zhong)一(yi)注(zhu)射(she)器(qi)作(zuo)注(zhu)射(she)用(yong)。

　　（四）免疫方法

　　抗原劑量
，首次劑量為300～500μg

，加強免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右。每2～3周加強免疫一次。加強免疫時用不完全佐劑
，首次免疫時皮下注射百日咳疫苗0.5ml
，加強免疫時不必注射百日咳疫苗。

　　在第2次加強免疫後2周，從耳緣靜脈取2～3ml血，製備血清
，檢測抗體效價（見後）。如未達到預期效價
，需再進行加強免疫，直到滿意時為止（圖2-3）。當抗體效價達到預期水平時

，即可放血製備抗血清。

 

圖2-3 抗體反應

　　（五）抗血清的采集與保存

　　家兔是最常用以產生抗體的動物
，因此這裏主要討論兔血的收集。羊等較大動物以頸靜脈、動(dong)脈(mai)取(qu)血(xue)
，鼠(shu)等(deng)小(xiao)動(dong)物(wu)取(qu)血(xue)可(ke)參(can)閱(yue)有(you)關(guan)資(zi)料(liao)。取(qu)兔(tu)血(xue)有(you)兩(liang)種(zhong)方(fang)法(fa)
，一(yi)是(shi)耳(er)緣(yuan)靜(jing)脈(mai)或(huo)耳(er)動(dong)脈(mai)放(fang)血(xue)
，一(yi)是(shi)頸(jing)動(dong)脈(mai)入(ru)血(xue)，也(ye)可(ke)心(xin)髒(zang)采(cai)血(xue)。取(qu)動(dong)脈(mai)或(huo)靜(jing)脈(mai)放(fang)血(xue)時(shi)，將(jiang)兔(tu)放(fang)入(ru)一(yi)個(ge)特(te)造(zao)的(de)木(mu)匣(xia)或(huo)籠(long)內(nei)
，耳(er)露(lu)於(yu)箱(xiang)（籠）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯塗抹耳廓，30s後，耳血管擴張、充血。用手輕拉耳尖
，以單麵剃須刀或尖的手術刀片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然(ran)後(hou)用(yong)棉(mian)球(qiu)壓(ya)迫(po)止(zhi)血(xue)，凝(ning)血(xue)後(hou)洗(xi)去(qu)二(er)甲(jia)苯(ben)。二(er)星(xing)期(qi)後(hou)
，可(ke)在(zai)另(ling)一(yi)耳(er)放(fang)血(xue)。此(ci)法(fa)可(ke)反(fan)複(fu)多(duo)次(ci)放(fang)血(xue)。頸(jing)動(dong)脈(mai)放(fang)血(xue)時(shi)

，將(jiang)兔(tu)仰(yang)臥(wo)，固(gu)定(ding)於(yu)兔(tu)台(tai)，剪(jian)去(qu)頸(jing)部(bu)的(de)毛(mao)
，切(qie)開(kai)皮(pi)膚(fu)
，暴(bao)露(lu)頸(jing)動(dong)脈(mai)
，插(cha)管(guan)，放(fang)血(xue)。放(fang)血(xue)過(guo)程(cheng)中(zhong)要(yao)嚴(yan)格(ge)按(an)無(wu)菌(jun)要(yao)求(qiu)進(jin)行(xing)。

　　收集的血液置於室溫下1h左右，凝固後
，置4℃下

，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml），貯於-40℃以下冰箱
，或凍幹後貯存於4。C冰箱保存。

　　（六）抗血清質量的評價

　　在免疫期間
，不僅各個不同的動物，而且同一動物在不同的時間內抗血清效價、特異性
、親合力等都可能發生變化
，因而必須經常地采血測試。隻有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方麵作徹底的評價後，才可使用所取得的抗血清。

　　1．效價 　抗血清的效價，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是放射免疫法

，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產生的抗體，可用雙擴散等方法測定。前者測定的效價極為精確。而後者則粗糙得多。

　　（1）放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優質標記抗原混合
，孵育24h後，測定其結合率。通常以結合率為50%的血清稀度和為效價。如某抗血清的結合率為50%時的稀釋度為1：15000
，則該血清的效價就是1：15000。抗血清的效價，除由抗血清本身的性質決定外
，還受標記抗原的質量、孵育時間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。（測定方法見第8章　）

　　（2）雙向擴散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴散，兩者在相交處產生沉澱線
，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。

　　球脂板的製備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩衝液加到15g的瓊脂內
，於水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時
，加入疊氮鈉（NaN3）
，使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在幹淨平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固後
，用打孔器打孔（圖2-4）。中央孔內加適量抗原（容量為50μl），周圍各孔內分別加入50μl 1：2、1：4
、1：8
、1：16
、1：32及不稀釋的抗血清

，37℃下孵育24h，觀察有無沉澱線產生，以判斷血清的稀釋度（圖2-5）。

 

圖2-4 雙向擴散模型

 

圖2-5 免疫擴散試驗

　　2．特異性測定 　　抗(kang)血(xue)清(qing)的(de)特(te)異(yi)性(xing)或(huo)稱(cheng)專(zhuan)一(yi)性(xing)是(shi)指(zhi)抗(kang)血(xue)清(qing)對(dui)相(xiang)應(ying)的(de)抗(kang)原(yuan)及(ji)近(jin)似(si)的(de)抗(kang)原(yuan)物(wu)質(zhi)的(de)識(shi)別(bie)能(neng)力(li)。特(te)異(yi)性(xing)好(hao)就(jiu)是(shi)抗(kang)血(xue)清(qing)的(de)識(shi)別(bie)能(neng)力(li)強(qiang)。通(tong)常(chang)，特(te)異(yi)性(xing)是(shi)以(yi)交(jiao)叉(cha)反(fan)應(ying)率(lv)來(lai)表(biao)示(shi)的(de)。交(jiao)叉(cha)反(fan)應(ying)率(lv)低(di)，表(biao)示(shi)抗(kang)血(xue)清(qing)的(de)特(te)異(yi)性(xing)好(hao)
，反(fan)之(zhi)則(ze)特(te)異(yi)性(xing)差(cha)。交(jiao)叉(cha)反(fan)應(ying)率(lv)一(yi)般(ban)是(shi)用(yong)競(jing)爭(zheng)抑(yi)製(zhi)曲(qu)線(xian)來(lai)判(pan)斷(duan)的(de)。以(yi)不(bu)同(tong)濃(nong)度(du)的(de)抗(kang)原(yuan)和(he)近(jin)似(si)抗(kang)原(yuan)物(wu)質(zhi)分(fen)別(bie)做(zuo)競(jing)爭(zheng)抑(yi)製(zhi)曲(qu)線(xian)，計(ji)算(suan)各(ge)自(zi)的(de)結(jie)合(he)率(lv)（B/T或B/B0），求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應率。

　　S=y/Z×100%

　　S：交叉反應率，y：IC50時抗原濃度，Z：IC50時近似抗原物質的濃度。

　　如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質IC50濃度幾乎是無限大，可以說這一抗血清與其它抗原物質的交叉反應率近似零
，即無交叉反應，該抗血清的特異性是好的。

　　3．親合力 　　在免疫學中
， 親(qin)合(he)力(li)是(shi)指(zhi)抗(kang)體(ti)與(yu)結(jie)合(he)抗(kang)原(yuan)體(ti)的(de)活(huo)度(du)或(huo)牢(lao)固(gu)度(du)。抗(kang)體(ti)與(yu)抗(kang)原(yuan)結(jie)合(he)疏(shu)鬆(song)，結(jie)合(he)後(hou)會(hui)迅(xun)速(su)解(jie)離(li)
，稱(cheng)為(wei)親(qin)合(he)力(li)低(di)，反(fan)之(zhi)，親(qin)合(he)力(li)高(gao)。親(qin)合(he)力(li)的(de)高(gao)低(di)是(shi)由(you)抗(kang)原(yuan)分(fen)子(zi)的(de)大(da)小(xiao)，抗(kang)體(ti)分(fen)子(zi)的(de)結(jie)合(he)位(wei)點(dian)與(yu)抗(kang)原(yuan)的(de)決(jue)定(ding)基(ji)之(zhi)間(jian)的(de)立(li)體(ti)結(jie)構(gou)型(xing)的(de)合(he)適(shi)程(cheng)度(du)決(jue)定(ding)的(de)。親(qin)合(he)力(li)常(chang)以(yi)親(qin)合(he)常(chang)數(shu)K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達到的最小檢出量（靈敏度）的倒數，K=1/[H]
，[H]是最小檢出量
，通常，K的範圍在108～1012L/mol之間，也有高達1014L/mol的。

　　計算親合常數的方法20餘種，計算出的K都不能真實反映實驗情況，隻能作為參考。

　　（七）免疫失敗的可能原因及應采取的措施

　　有時不能獲得滿意的抗血清
，可從下列幾方麵找原因，並改進之。

　　（1）免疫動物的種屬及品係是否合適
，可考慮改變動物的種屬或品係，或擴大免疫動物的數量。

　　（2）抗原質量是否良好，可改用其它廠家的產品或改用同一廠家的其它批號
，也可考慮改變抗原分子的部分結構
，或改進提取方法。

　　（3）製備的免疫原是否符合要求，可從偶聯劑，載體

、抗原或載體的比例
、反應時間等多方麵去考慮
，並加以改進。

　　（4）所用的佐劑是否合適，乳化是否完全
，可改用其它佐劑，或加強乳化。

　　（5）免疫的方法、劑量
，加強免疫的間隔時間和次數，免疫的途徑是否合適。

　　（6）動物的飼養是否得當
，如營養（飼料
、飲水）、環境衛生（通風、采光、溫度）是否符合要求
，動物的健康情況是否良好等。

　　二、單克隆抗體的製備

　　1975年Kohler和Milstein發(fa)現(xian)將(jiang)小(xiao)鼠(shu)骨(gu)髓(sui)瘤(liu)細(xi)胞(bao)與(yu)和(he)綿(mian)羊(yang)紅(hong)細(xi)胞(bao)免(mian)疫(yi)的(de)小(xiao)鼠(shu)脾(pi)細(xi)胞(bao)進(jin)行(xing)融(rong)合(he)，形(xing)成(cheng)的(de)雜(za)交(jiao)瘤(liu)細(xi)胞(bao)既(ji)可(ke)產(chan)生(sheng)抗(kang)體(ti)，又(you)可(ke)無(wu)性(xing)繁(fan)殖(zhi)，從(cong)而(er)創(chuang)立(li)了(le)單(dan)克(ke)隆(long)抗(kang)體(ti)雜(za)交(jiao)瘤(liu)技(ji)術(shu)。這(zhe)一(yi)技(ji)術(shu)上(shang)的(de)突(tu)破(po)使(shi)血(xue)清(qing)學(xue)的(de)研(yan)究(jiu)進(jin)入(ru)了(le)一(yi)個(ge)高(gao)度(du)精(jing)確(que)的(de)新(xin)紀(ji)元(yuan)。

　　免疫細胞化學的 技術關鍵之一是製備特異性強、親合力大、滴(di)度(du)高(gao)的(de)特(te)異(yi)性(xing)抗(kang)體(ti)，由(you)於(yu)每(mei)種(zhong)抗(kang)原(yuan)都(dou)有(you)幾(ji)個(ge)抗(kang)原(yuan)決(jue)定(ding)簇(cu)，用(yong)它(ta)免(mian)疫(yi)動(dong)物(wu)將(jiang)產(chan)生(sheng)對(dui)各(ge)個(ge)決(jue)定(ding)簇(cu)的(de)抗(kang)體(ti)
，即(ji)多(duo)克(ke)隆(long)抗(kang)體(ti)。單(dan)克(ke)隆(long)抗(kang)體(ti)則(ze)是(shi)由(you)一(yi)個(ge)產(chan)生(sheng)抗(kang)體(ti)的(de)細(xi)胞(bao)與(yu)一(yi)個(ge)骨(gu)髓(sui)瘤(liu)細(xi)胞(bao)融(rong)合(he)而(er)形(xing)成(cheng)的(de)雜(za)交(jiao)廇(廇)細(xi)胞(bao)經(jing)無(wu)性(xing)繁(fan)殖(zhi)而(er)來(lai)的(de)細(xi)胞(bao)群(qun)所(suo)產(chan)生(sheng)的(de)，所(suo)以(yi)它(ta)的(de)免(mian)疫(yi)球(qiu)蛋(dan)白(bai)屬(shu)同(tong)一(yi)類(lei)型(xing)，質(zhi)地(di)純(chun)一(yi)，而(er)且(qie)它(ta)是(shi)針(zhen)對(dui)某(mou)一(yi)抗(kang)原(yuan)決(jue)定(ding)簇(cu)的(de)，因(yin)此(ci)特(te)異(yi)性(xing)強(qiang)，親(qin)合(he)性(xing)也(ye)一(yi)致(zhi)。單(dan)克(ke)隆(long)抗(kang)體(ti)（McAb）的特性和常規血清抗體的特性比較見2-3。

表2—3 單克隆抗體（McAb）和常規免疫血清抗體的特性比較

　　單克隆抗體的製備方法如下。

　　（一）動物的選擇與免疫

　　1．動物的選擇 　純種BALB/Cxiaoshu，jiaowenshun
，liwodehuodongfanweixiao
，tiruo，shiliangjipaiwujiaoxiao，yibanhuanjingjiejingdeshiyanshijunnengsiyangchenghuo。muqiankaizhanzajiaoliujishudeshiyanshiduoxuanyongchunzhongBALA/C小鼠。

　　2．免疫方案 　　選擇合適的免疫方案對於細胞融合雜交的成功
，獲得高質量的McAb至關重要。一般在融合前兩個月左右根據確立免疫方案開始初次免疫
，免疫方案應根據抗原的特性不同而定。

　　（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應先製備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑

、福氏不完全佐劑。

　　初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內注射（一般0.8～1ml,0.2ml/點）

　　↓3周後

　　第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）

　　↓3周後

　　第三次免疫 劑量同一
，不加佐劑

，ip（5～7天後采血測其效價）

　　↓2～3周

　　加強免疫
，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內注射）

　　↓3天後

　　取脾融合

　　目前，用於可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆粒化或固相化
，一方麵增強了抗原的免疫原性，另一方麵可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎免疫可直接采用脾內注射。③使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應答水平，增強免疫細胞對抗原的反應性。

　　（2）顆粒抗原免疫性強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×107個細胞。

　　初次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓2～3周後

　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓3周後

　　加強免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv

　　↓

　　取脾融合

　　（二）細胞融合

　　1．細胞融合前準備

　　（1）骨髓瘤細胞係的選擇：骨髓瘤細胞應和免疫動物屬於同一品係
，這樣雜交融合率高，也便於接種雜交瘤在同一品係小鼠腹腔內產生大量McAb。常用的骨髓瘤細胞係見表2-4。

表2-4用於融合試驗的主要骨髓瘤細胞係

　　骨髓瘤細胞的培養可用一般的培養液，如RPMI1640，DMEM培養基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當細胞處於對數生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細胞在傳代過程中
，部分細胞可能有返祖現象，應定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。

　　（2）飼養細胞：zaizuzhipeiyangzhong，dangehuoshaoshufensandexibaobuyishengchangfanzhi，ruojiaruqitahuoxibao，zekecujinzhexiexibaoshengchangfanzhi，suojiarudezhezhongxibaoshubeichengweisiyangxibao。zaizhibeiMcAb的過程中，許多環節　需要加飼養細胞

，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養過程中，加入飼養細胞是十分必要的。常用的飼養細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾髒細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞係3T3經放射線照射後作為飼養細胞。飼養細胞的量為一般為2×104或105細胞/孔。

　　2．細胞融合的步驟

　　（1）製備飼養細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。

　　與免疫小鼠相同品係的小鼠
，常用BALB/C小鼠，6～10周

↓

　　拉頸 處死


，浸泡在75%酒精內，3～5min

　　↓

　　用無菌剪刀剪開皮膚
，暴露腹膜

　　↓

　　用無菌注射器注入5～6ml預冷的培養液（嚴禁刺破腸管）

　　↓

　　反複衝洗，吸出衝洗液

　　↓

　　衝洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min

　　↓

　　用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養液混懸

，調整細胞數至1×105/ml

　　↓

　　加入96孔板
，100μl/孔

　　↓

　　放入37。c CO2孵箱培養

　　（2）製備免疫脾細胞

　　最後一次加強免疫3天後小鼠拉頸處死

　　↓

　　無菌取脾髒，培養液洗 一次

　　↓

　　脾髒研碎
，過不鏽鋼篩網

　　↓

　　離心，細胞用培養液洗2次

　　↓

　　計數

　　↓

　　取108脾淋巴細胞懸液備用

　　（3）製備骨髓瘤細胞

　　取對數生長骨髓瘤細胞離心

　　↓

　　用無血清培養液洗2次

　　↓

　　計數，取得×107細胞備用

　　（4）融合

　　①將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗1次

，離心
，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸淨殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉澱略鬆動。

　　②90s內加入37℃預溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液
，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。

　　③加37。C預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml
、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

　　④離心

，800rpm, 6min。

　　⑤充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養液重懸。

　　⑥將上述細胞
，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100μl。一般一個免疫脾髒可接種4塊96孔板。

　　⑦將培養板置37℃、5%CO2培養箱中培養。

　　（三）選擇雜交瘤細胞及抗體檢測

　　1．HAT選擇雜交瘤細胞 　　　脾細胞和骨髓瘤細胞經PEG處理後，形成多種細胞的混合體，隻有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在HAT選xuan擇ze培pei養yang液ye中zhong培pei養yang時shi

，由you於yu骨gu髓sui瘤liu細xi胞bao缺que乏fa胸xiong苷gan激ji酶mei或huo次ci黃huang嘌piao呤ling鳥niao嘌piao呤ling核he糖tang轉zhuan移yi酶mei，故gu不bu能neng生sheng長chang繁fan殖zhi，而er雜za交jiao瘤liu細xi胞bao具ju有you上shang述shu兩liang種zhong酶mei，在zaiHAT選擇培養液可以生長繁殖。

　　在用HAT選擇培養1～2天內，將有大量瘤細胞死亡

，3～4天後瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養液維持7～10天後應換用HT培養液，再維持2周，改用一般培養液。在上述選擇培養期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10麵積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞係。在選擇培養期間，一般每2～3天換一半培養液。

　　2．抗體的檢測　　 檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法

，一般以快速、簡便

、特異、敏感的方法為原則。

　　常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用於可溶性抗原
、細胞McAb的檢測。（2）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）可用於可溶性抗原
、細胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合於細胞表麵抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細胞毒性試驗
、旋轉粘附雙層吸附試驗等。

　　（四）雜交瘤的克隆化

　　雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經過HAT篩選後的雜交瘤克隆不能保證一個孔內隻有一個克隆。在實際工作中
，可能會有數個甚至更多的克隆
，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、所需要的抗體（特異性抗體）分fen泌mi細xi胞bao和he其qi它ta無wu關guan抗kang體ti的de分fen泌mi細xi胞bao。要yao想xiang將jiang這zhe些xie細xi胞bao彼bi此ci分fen開kai就jiu需xu要yao克ke隆long化hua。克ke隆long化hua的de原yuan則ze是shi，對dui於yu檢jian測ce抗kang體ti陽yang性xing的de雜za交jiao克ke隆long盡jin早zao進jin行xing克ke隆long化hua
，否fou則ze抗kang體ti分fen泌mi的de細xi胞bao會hui被bei抗kang體ti非fei分fen泌mi的de細xi胞bao所suo抑yi製zhi
，因yin為wei抗kang體ti非fei分fen泌mi細xi胞bao的de生sheng長chang速su度du比bi抗kang體ti分fen泌mi的de細xi胞bao生sheng長chang速su度du快kuai，二er者zhe競jing爭zheng的de結jie果guo會hui使shi抗kang體ti分fen泌mi的de細xi胞bao丟diu失shi。即ji使shi克ke隆long化hua過guo的de雜za交jiao瘤liu細xi胞bao也ye需xu要yao定ding期qi的de再zai克ke隆long，以yi防fang止zhi雜za交jiao瘤liu細xi胞bao的de突tu變bian或huo染ran色se體ti丟diu失shi，從cong而er喪sang失shi產chan生sheng抗kang體ti的de能neng力li。

　　克隆化的方法很多，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。

　　1．有限稀釋法克隆

　　（1）克隆前1天製備飼養細胞層（同細胞融合）。

　　2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養孔內輕輕吹幹，計數。

　　（3）調整細胞為3～10個細胞/ml。

　　（4）取頭天準備的飼養細胞層的細胞培養板，每孔加入稀釋細胞100μl。孵育於37℃、5%CO2孵箱中 。

　　（5）在第7天換液，以後每2～3天換液1次。

　　（6）8～9天可見 細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。

　　（7）將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養。

　　（8）每個克隆應盡快凍存。

　　2．軟瓊脂培養法克隆

　　（1）軟瓊脂的配製：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。

　　①1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。

　　②0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配製而成。置42℃保溫。

　　（2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養細胞）15ml傾注於直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固後作為基底層備用。

　　（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配製需克隆的細胞懸液。

　　（4）1ml 0.5%瓊脂液（42℃預熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。

　　（5）混勻後立傾注於瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育於37℃、5%CO2孵箱中。

　　（6）4～5天 後即可見針尖大小白色克隆，7～10天後，直接移種至含飼養細胞的24孔中進行培養。

　　（7）檢測抗體，擴大培養，必要是地再克隆化。

　　（五）雜交瘤細胞的凍存與複蘇

　　1．雜交瘤細胞的凍存　　 及ji時shi凍dong存cun原yuan始shi孔kong的de雜za交jiao瘤liu細xi胞bao每mei次ci克ke隆long化hua得de到dao的de亞ya克ke隆long細xi胞bao是shi十shi分fen重zhong要yao的de。因yin為wei在zai沒mei有you建jian立li一yi個ge穩wen定ding分fen泌mi抗kang體ti的de細xi胞bao係xi的de時shi候hou
，細xi胞bao的de培pei養yang過guo程cheng中zhong隨sui時shi可ke能neng發fa生sheng細xi胞bao的de汙wu染ran
、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。

　　雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞係的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養環境不同而改變，在24孔培養板中培養，當長滿孔底時
，一孔就可以裝一支安瓿凍存。

　　細胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養液；10%DMSO（二甲基亞碸）。

　　凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃後放入-70℃超chao低di溫wen冰bing箱xiang，次ci日ri轉zhuan入ru液ye氮dan中zhong。也ye可ke用yong細xi胞bao凍dong存cun裝zhuang置zhi進jin行xing凍dong存cun。凍dong存cun細xi胞bao要yao定ding期qi複fu蘇su，檢jian查zha細xi胞bao的de活huo性xing和he分fen泌mi抗kang體ti的de穩wen定ding性xing
，在zai液ye氮dan中zhong細xi胞bao可ke保bao存cun數shu年nian或huo更geng長chang時shi間jian。

　　2．細胞複蘇方法 　將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min內使凍存的細胞解凍，將細胞用完全培養液洗滌兩次
，然後移入頭天已製備好的飼養層細胞的培養瓶內，置37℃、5%CO2孵箱中培養，當細胞形成集落時
，檢測抗體活性。

　　（六）單克隆抗體的大量生產

　　大量生產單克隆抗體的方法主要有兩種：

　　（1）體外使用旋轉培養管大量培養雜交瘤細胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產量低
，一般培養液內抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產，費用較高。

　　（2）體內接種雜交瘤細胞，製備腹水或血清。

　　①實體瘤法：對數生長期的雜交瘤細胞按1～3×107/ml接種於小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點。待腫瘤達到一定大小後（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達到1～10mg/ml。但采血量有限。

　　②腹水的製備：常規是先腹腔注射0.5ml Pristane 降植烷或液體石蠟於BALB/C鼠
，1～2周後腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天(tian)後(hou)可(ke)產(chan)生(sheng)腹(fu)水(shui)，密(mi)切(qie)觀(guan)察(cha)動(dong)物(wu)的(de)健(jian)康(kang)狀(zhuang)況(kuang)與(yu)腹(fu)水(shui)征(zheng)象(xiang)，待(dai)腹(fu)水(shui)盡(jin)可(ke)能(neng)多(duo)
，而(er)小(xiao)鼠(shu)頻(pin)於(yu)死(si)亡(wang)之(zhi)前(qian)
，處(chu)死(si)小(xiao)鼠(shu)，用(yong)滴(di)管(guan)將(jiang)腹(fu)水(shui)吸(xi)入(ru)試(shi)管(guan)中(zhong)，一(yi)般(ban)一(yi)隻(zhi)小(xiao)鼠(shu)可(ke)獲(huo)5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反複收集數次。腹水中單克隆抗體含量可達到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，複蘇後轉種小鼠腹腔則產生腹水塊、量多。

　　（七）單克隆抗體的鑒定

　　對製備的McAb進行係統的鑒定是十分必要的
，應做下述幾個方麵的鑒定：

　　1．抗體特異性的鑒定 　　除用免疫原（抗原）進行抗體的檢測外，還應該用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如：①製備抗黑色素瘤細胞的McAb，除chu用yong黑hei色se素su瘤liu細xi胞bao反fan應ying外wai，還hai應ying該gai用yong其qi它ta髒zang器qi的de腫zhong瘤liu細xi胞bao和he正zheng常chang細xi胞bao進jin行xing交jiao叉cha反fan應ying，以yi便bian挑tiao選xuan腫zhong瘤liu特te異yi性xing或huo腫zhong瘤liu相xiang關guan抗kang原yuan的de單dan克ke隆long抗kang體ti。②製備抗重組的細胞因子的單克隆抗體
，應首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應
，其次是與其它細胞因子間有無交叉。

　　2．McAb的Ig類與亞類的鑒定　　一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時已經基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM
，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至於亞類則需要用標準抗亞類血清係統作雙擴或夾心ELISA來確定。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG（3%）
，更有利於沉澱線的形成。

　　3．McAb中和活性的鑒定 　　　用動物或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種於易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。

　　4．McAb識別抗原表位的鑒定　　用競爭結合試驗，測相加指數的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。

　　5．McAb親合力的鑒定　 用ELISA或RIA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親合力。