製備單克隆抗體包括動物免疫、細胞融合、選擇雜交瘤
、檢測抗體、雜交瘤細胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產
，要經過幾個月的一係列實驗步驟，下麵按照製備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實驗方法。

　　一、細胞融合前準備

　　一　免疫方案

　　選擇合適的免疫方案對於細胞融合雜交的成功
，獲得高質量的McAb至關重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫
，免疫方案應根據抗原的特性不同而定。

　　1.　顆粒性抗原免疫性較強

，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下麵以細胞性抗原為例的免疫方案:

　　　　　　　　　　初次免疫　　　　　　　1×10７／0.5ml ip 腹腔內注射

　　　　　　　　　　　　↓　2～3周後

　　　　　　　　　　第二次免疫　　　　　　1×10７／0.5ml ip

　　　　　　　　　　　　↓　3周後

　　　　　　　　　　加強免疫融合前三天　1×10７／0.5ml ip或iv靜脈內注射

　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　取脾融合

　　2.　可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑
，常用佐劑：福(fu)氏(shi)完(wan)全(quan)佐(zuo)劑(ji)，福(fu)氏(shi)不(bu)完(wan)全(quan)佐(zuo)劑(ji)。要(yao)求(qiu)抗(kang)原(yuan)和(he)佐(zuo)劑(ji)等(deng)體(ti)積(ji)混(hun)合(he)在(zai)一(yi)起(qi)，研(yan)磨(mo)成(cheng)油(you)包(bao)水(shui)的(de)乳(ru)糜(mi)狀(zhuang)，放(fang)一(yi)滴(di)在(zai)水(shui)麵(mian)上(shang)不(bu)易(yi)馬(ma)上(shang)擴(kuo)散(san)呈(cheng)小(xiao)滴(di)狀(zhuang)表(biao)明(ming)已(yi)達(da)到(dao)油(you)包(bao)水(shui)的(de)狀(zhuang)態(tai)。商(shang)品(pin)化(hua)福(fu)氏(shi)完(wan)全(quan)佐(zuo)劑(ji)在(zai)使(shi)用(yong)前(qian)須(xu)振(zhen)搖(yao)，使(shi)沉(chen)澱(dian)的(de)分(fen)枝(zhi)杆(gan)菌(jun)充(chong)分(fen)混(hun)勻(yun)。

　　　　　　初次免疫　 Ag　1～50μg　加福氏完全佐劑皮下多點注射

　　　　　　　　│　　　　　一般0.8～1ml　0.2ml／點

　　　　　　　　↓3周後

　　　　　　第二次免疫　劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip

　　　　　　　　│　　　　　　　ip劑量不宜超過0.5ml

　　　　　　　　↓3周後

　　　　　　　第三次免疫　劑量同上，不加佐劑，ip

　　　　　　　　│ 5～7天後采血測其效價
，檢測免疫效果

　　　　　　　　↓2～3周後

　　　　　　加強免疫

，劑量50～500μg為宜，ip或iv

　　　　　　　　↓3天後

　　　　　　　取脾融合

　　目前，用於可溶性抗原特別是一些弱抗原的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方麵增強了抗原的免疫原性，另一方麵可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎免疫可直接采用脾內注射。③使用細胞因子作為佐劑
，提高機體的免疫應答水平，促進免疫細胞對抗原反應性。

　　二　飼養細胞

　　在製備單克隆抗體過程中，許多環節需要加飼養細胞，如：在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養過程中，加入飼養細胞是十分必要的。常用的飼養細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞較為常用、小鼠脾髒細胞或小鼠胸腺細胞，也有人用小鼠成纖維細胞係3T3經放射線照射後作為飼養細胞，使用比較方便，照射後可放入液氮罐長期保存，隨用隨複蘇。

　　　　　小鼠腹腔巨噬細胞的製備

　　　　　小鼠采用與免疫小鼠相同的品係，常用BaLb／c小鼠6～10周齡

　　　　　　↓

　　　　　拉頸處死　浸泡於75％酒精
，消毒3～5分鍾

　　　　　　↓

　　　　　用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜

　　　　　　↓

　　　　　用無菌注射器注入6～8ml培養液

　　　　　　↓

　　　　　反複衝洗，吸出衝洗液

　　　　　　↓

　　　　　放入10ml離心管
，1200轉／分離心5～6分鍾

　　　　　　↓

　　　　　用20％小牛血清NCS或胎牛血清FCS的培養液混懸
，調整細胞數1×10５／ml

　　　　　　↓

　　　　　加入96孔板，100μl／孔

　　　　　　↓

　　　　　放入37℃　CO2孵箱培養

　　一般飼養細胞在融合前一天製備，一隻小鼠可獲得5～8×106腹腔巨噬細胞，若用小鼠胸腺細胞作為飼養細胞時，細胞濃度為5×106／ml，小鼠脾細胞為1×106／ml
，小鼠的成纖維細胞3T31×105／ml，均為100μl／孔。

　　三　骨髓瘤細胞

　　骨髓瘤細胞係應和免疫動物屬於同一品係，這樣雜交融合率高，也便於接種雜交瘤細胞在同一品係小鼠腹腔內產生大量　McAb。

　　常用骨髓瘤細胞係有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。

　　骨髓瘤細胞的培養適合於一般的培養液
，如RPMI1640，DMEM培養基。小牛血清的濃度一般在10～20％
，細胞的最大密度不得超10６／ml
，一般擴大培養以1∶10稀釋傳代，每3～5天傳代一次。細胞的倍增時間為16～20小時
，上述三株骨髓瘤細胞係均為懸浮或輕微貼壁生長
，隻用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細胞。

　　一般在準備融合前的兩周就應開始複蘇骨髓瘤細胞，為確保該細胞對HAT的敏感性，每3～6月應用8～AG8氮雜鳥嘌呤篩選一次，以防止細胞的突變。

　　保證骨髓瘤細胞處於對數生長期，良好的形態，活細胞計數高於95％
，也是決定細胞融合的關鍵。

　　四　免疫脾細胞

　　免疫脾細胞指的是處於免疫狀態脾髒中B淋巴母細胞棗漿母細胞。一般取最後一次加強免疫3天以後的脾髒，製備成細胞懸液，由於此時B淋巴母細胞比例較大，融合的成功率較高。

　　脾細胞懸液的製備：zaiwujuntiaojianxiaquchupizang，yongbuwanquandepeiyangyexiyici，zhipingminzhongbuxiugangshaiwangshang，yongzhusheqizhenxinyanmochengxibaoxuanyehoujishu。yibanmianyihoupizangtijiyueshizhengchangshupizangtijide２倍
，細胞數為２×10８左右。

　　二、細胞融合
，選擇雜交瘤

　　一　細胞融合流程

　　1　取對數生長的骨髓瘤細胞SP2／0，1000rpm離心5分鍾，棄上清，用不完全培養液混懸細胞後計數
，取所需的細胞數

，用不完全培養液洗滌2次。

　　2　同時製備免疫脾細胞懸液
，用不完全培養液洗滌2次。

　　3　將骨髓瘤細胞與脾細胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內用不完全培養液洗1次，1200rpm,8分鍾。

　　4　棄上清，用滴管吸淨殘留液體，以免影響PEG的濃度。

　　5　輕輕彈擊離心管底，使細胞沉澱略加鬆動。

　　6　在室溫下融合:

　　①　30秒內加入預熱的1ml45％PEGMerek,分子量4000含5％DMSO
，邊加邊攪拌。

　　②　作用90秒鍾，若冬天室溫較低時可延長至120秒鍾。

　　③　加預熱的不完全培養液
，終止PEG作用，每隔２分鍾分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

　　7　離心，800rpm，6分鍾。

　　8　棄上清
，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸
，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細胞散開。

　　9　根據所用96孔培養板的數量，補加完全培養液，10ml一塊96孔板。

　　10 將融合後細胞懸液加入含有飼養細胞的96孔板，100μl／孔
，37℃、5％CO2孵箱培養。

　　一般一塊96孔板含有1×107脾細胞。

　　二　HAT選擇雜交瘤

　　應用HAT 選擇培養液篩選雜交瘤細胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經提到，這裏主要介紹加HAT選擇培養的時間和濃度。

　　一般在融合24小時後
，加HAT選擇培養液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時1ml加入50ml20％小牛血清完全培養液中。

　　因為在培養板內已加入飼養細胞、融合後的細胞
，200μl／孔。所以在加選擇培養液時應加3倍量的HAT。我們認為
，融合後最初補加的量可用全量的2／3進行選擇
，可得到滿意的篩選結果。

　　50×HAT

　　H:　5×10-3M

　　A:　2×10-5M

　　T:　8×10-4M

　　一般選擇HAT選擇培養液維持培養兩周後，改用HT培養液，再維持培養兩周，改用一般培養液。

　　三
、抗體的檢測

　　篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養而獲得雜交細胞係中，僅少數能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細胞布滿孔底1／10麵積時，即可開始檢測特異性抗體
，篩選出所需要的雜交瘤細胞係。

　　檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同
，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。

　　常用的方法有:

　　1.　ELISA用於可溶性抗原蛋白質、細胞和病毒等McAb的檢測。

　　2.　RIA用於可溶性抗原
、細胞McAb的檢測。

　　3.　FACS熒光激活細胞分類儀用於檢查細胞表麵抗原的McAb檢測。

　　4.　IFA用於細胞和病毒McAb的檢測。

　　上述方法均為一般實驗室的常規方法，故在此不介紹具體的實驗過程。

　　可靠的篩選方法必須在融合前建立
，避免由於方法不當貽誤整個篩選時機。

　　四
、雜交瘤的克隆化和凍存

　　克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。犚r為經過HAT篩選後的雜交瘤克隆不能保證一個孔內隻有一個克隆。在實際工作中，可能會有數個甚至更多的克隆
，可能包括抗體分泌細胞
、抗體非分泌細胞；所(suo)需(xu)要(yao)的(de)抗(kang)體(ti)特(te)異(yi)性(xing)抗(kang)體(ti)分(fen)泌(mi)細(xi)胞(bao)和(he)其(qi)它(ta)無(wu)關(guan)抗(kang)體(ti)分(fen)泌(mi)細(xi)胞(bao)。要(yao)想(xiang)將(jiang)這(zhe)些(xie)細(xi)胞(bao)彼(bi)此(ci)分(fen)開(kai)，就(jiu)需(xu)要(yao)克(ke)隆(long)化(hua)。克(ke)隆(long)化(hua)的(de)原(yuan)則(ze)是(shi)，對(dui)於(yu)檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)陽(yang)性(xing)的(de)雜(za)交(jiao)克(ke)隆(long)應(ying)盡(jin)早(zao)進(jin)行(xing)克(ke)隆(long)化(hua)
，否(fou)則(ze)抗(kang)體(ti)分(fen)泌(mi)的(de)細(xi)胞(bao)會(hui)被(bei)抗(kang)體(ti)非(fei)分(fen)泌(mi)的(de)細(xi)胞(bao)所(suo)抑(yi)製(zhi)
，因(yin)為(wei)抗(kang)體(ti)非(fei)分(fen)泌(mi)細(xi)胞(bao)的(de)生(sheng)長(chang)速(su)度(du)比(bi)抗(kang)體(ti)分(fen)泌(mi)的(de)細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)速(su)度(du)快(kuai)，二(er)者(zhe)競(jing)爭(zheng)的(de)結(jie)果(guo)會(hui)使(shi)抗(kang)體(ti)分(fen)泌(mi)的(de)細(xi)胞(bao)丟(diu)失(shi)。即(ji)使(shi)克(ke)隆(long)化(hua)過(guo)的(de)雜(za)交(jiao)瘤(liu)細(xi)胞(bao)也(ye)需(xu)要(yao)定(ding)期(qi)的(de)再(zai)克(ke)隆(long)
，以(yi)防(fang)止(zhi)雜(za)交(jiao)瘤(liu)細(xi)胞(bao)的(de)突(tu)變(bian)或(huo)染(ran)色(se)體(ti)丟(diu)失(shi)
，從(cong)而(er)喪(sang)失(shi)產(chan)生(sheng)抗(kang)體(ti)的(de)能(neng)力(li)。

　　一　克隆化方案

　　用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。

　　1.　有限稀釋法的程序

　　①　製備飼養細胞懸液同融合前準備

　　②　陽性孔細胞的計數，並調細胞數在1～5×10３／ml

　　③　取130個細胞放入6.5ml含飼養細胞完全培養液，即20個細胞／ml，100μl／孔加A、B
、C三排為每孔2個細胞。餘下2.9ml細胞懸液補加2.9ml含飼養細胞的完全培養液,細胞數為10個／ml，100μl／孔加D、E

、F三排，為每孔1個細胞。餘下2.2ml細胞懸液補加2.2ml含飼養細胞的完全培養液，細胞數5個／ml
，100μl／孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細胞。

　　④　培養4～5天後，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆
，補加完全培養液200μl／孔。

　　⑤　第8～9天時，肉眼可見細胞克隆

，及時進行抗體檢測。

　　注:初次克隆化的雜交瘤細胞需要在完全培養液中加HT。

　　2.　軟瓊脂法

　　①　軟瓊脂的配製

　　含20％FCS小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640

　　1％瓊脂水溶液：高壓滅菌

，42℃預熱。

　　0.5％瓊脂：由1份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配製而成。置42℃保溫。

　　②　用上述0.5％瓊脂液含有飼養細胞15ml傾注於直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固後作為基底層備用。

　　③　按100／ml，500／ml或5000／ml等濃度配製需克隆的細胞懸液。

　　④　1ml 0.5％瓊脂液42℃預熱在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。

　　⑤　混勻後立即傾注於瓊脂基底層上，在室溫中10分鍾，使其凝固，孵育於37℃，5％CO2孵箱中。

　　⑥　4～5天後即可見針尖大小白色克隆，7～10天後，直接移種至含飼養細胞的24孔板中進行培養。

　　⑦　檢測抗體
，擴大培養，必要時再克隆化。

　

　　二　雜交瘤細胞的凍存

　　及時凍存原始孔的雜交瘤細胞
、每(mei)次(ci)克(ke)隆(long)化(hua)得(de)到(dao)的(de)亞(ya)克(ke)隆(long)細(xi)胞(bao)是(shi)十(shi)分(fen)重(zhong)要(yao)的(de)。因(yin)為(wei)在(zai)沒(mei)有(you)建(jian)立(li)一(yi)個(ge)穩(wen)定(ding)分(fen)泌(mi)抗(kang)體(ti)的(de)細(xi)胞(bao)係(xi)的(de)時(shi)候(hou)，細(xi)胞(bao)的(de)培(pei)養(yang)過(guo)程(cheng)中(zhong)隨(sui)時(shi)可(ke)能(neng)發(fa)生(sheng)細(xi)胞(bao)的(de)汙(wu)染(ran)
、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存
，則因為上述的意外而全功盡棄。

　　雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞係的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上


，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養環境不同而改變
，在24孔培養板中培養，當長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。

　　細胞凍存液:

　　50％小牛血清

　　40％不完全培養液

　　10％　DMSO二甲亞碸

　　凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0℃，再降溫時一般按每分鍾降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或細胞管降至0℃ 後放-70℃超(chao)低(di)溫(wen)冰(bing)箱(xiang)，次(ci)日(ri)轉(zhuan)入(ru)液(ye)氮(dan)中(zhong)。也(ye)可(ke)以(yi)用(yong)細(xi)胞(bao)凍(dong)存(cun)裝(zhuang)置(zhi)進(jin)行(xing)凍(dong)存(cun)。凍(dong)存(cun)細(xi)胞(bao)要(yao)定(ding)期(qi)複(fu)蘇(su)，檢(jian)查(zha)細(xi)胞(bao)的(de)活(huo)性(xing)和(he)分(fen)泌(mi)抗(kang)體(ti)的(de)穩(wen)定(ding)性(xing)，在(zai)液(ye)氮(dan)中(zhong)細(xi)胞(bao)可(ke)保(bao)存(cun)數(shu)年(nian)或(huo)更(geng)長(chang)時(shi)間(jian)。

　　五、單克隆抗體的大量生產

　　大量生產單克隆抗體的方法主要有兩種：

　　1.　體外使用旋轉培養管大量培養雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產量低
，一般培養液含量為10～60μg／ml，如果大量生產，費用較高。

　　2.　體內接種雜交瘤細胞，製備腹水或血清。

　　①　實體瘤法　對數生長期的雜交瘤細胞按1～3×107／ml接種於小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共2～4點。待腫瘤達到一定大小後一般10～20天則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達到1-10mg／ml。但采血量有限。

　　②　腹水的製備　常規是先腹腔注射0.5mlPristane降植烷或液體石臘於BaLb／c鼠，1～2周後腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天tian後hou可ke產chan生sheng腹fu水shui，密mi切qie觀guan察cha動dong物wu的de健jian康kang狀zhuang況kuang與yu腹fu水shui征zheng象xiang，待dai腹fu水shui盡jin可ke能neng多duo，而er小xiao鼠shu頻pin於yu死si亡wang之zhi前qian

，處chu死si小xiao鼠shu，用yong滴di管guan將jiang腹fu水shui吸xi入ru試shi管guan中zhong
，一yi般ban一yi隻zhi小xiao鼠shu可ke獲huo1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水
，可反複收集數次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，複蘇後轉種小鼠腹腔則產生腹水快、量多。

　　六
、單克隆抗體的鑒定

　　對製備的McAb進行係統的鑒定是十分必要的。應對其做如下方麵的鑒定:

　　1.　抗體特異性的鑒定：除用免疫原抗原進行抗體的檢測外
，還應用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA
、IFA法。例如①製備抗黑色素瘤細胞的McAb，除(chu)用(yong)黑(hei)色(se)素(su)瘤(liu)細(xi)胞(bao)反(fan)應(ying)外(wai)，還(hai)應(ying)用(yong)其(qi)它(ta)髒(zang)器(qi)的(de)腫(zhong)瘤(liu)細(xi)胞(bao)和(he)正(zheng)常(chang)細(xi)胞(bao)進(jin)行(xing)交(jiao)叉(cha)反(fan)應(ying)，以(yi)便(bian)挑(tiao)選(xuan)腫(zhong)瘤(liu)特(te)異(yi)性(xing)或(huo)腫(zhong)瘤(liu)相(xiang)關(guan)抗(kang)原(yuan)的(de)單(dan)克(ke)隆(long)抗(kang)體(ti)。②　製備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應，其次是與其它細胞因子間有無交叉。

　　2.　McAb的Ig類與亞類的鑒定：一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時，已經基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM
，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至於亞類則需要用標準抗亞類血清係統作雙擴或夾心ELISA來確定McAb的亞類。在作雙擴試驗時
，如加入適量的PEG3％
，將有利於沉澱線的形成。

　　3.　McAb中和活性的鑒定：用動物的或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種於易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。

　　4.　McAb識別抗原表位的鑒定：用競爭結合試驗
、測相加指數的方法，測定McAb所識別抗原位點

，來確定McAb的識別的表位是否相同。

　　5.　McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親和力。

　　七
、影響因素
、失敗原因分析

　　由於製備McAb的實驗周期長
，環節多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。

　　其主要失敗原因和影響因素有:

　　1.　汙染：包括細菌
、meijunhezhiyuantidewuran。zheshizajiaoliugongzuozhongzuilashoudewenti。yidanfaxianyoumeijunwuranjiuyingjizaojiangwuranbanqizhi，yimianwuranzhenggepeiyanghuanjing。zhiyuantidewuranzhuyaolaiyuanyuniuxueqing
，ciwai，qitatianjiaji、實(shi)驗(yan)室(shi)工(gong)作(zuo)人(ren)員(yuan)及(ji)環(huan)境(jing)也(ye)可(ke)能(neng)造(zao)成(cheng)支(zhi)原(yuan)體(ti)汙(wu)染(ran)。在(zai)有(you)條(tiao)件(jian)的(de)實(shi)驗(yan)室(shi)
，要(yao)對(dui)每(mei)一(yi)批(pi)小(xiao)牛(niu)血(xue)清(qing)和(he)長(chang)期(qi)傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)的(de)細(xi)胞(bao)係(xi)進(jin)行(xing)支(zhi)原(yuan)體(ti)的(de)檢(jian)查(zha)
，查(zha)出(chu)汙(wu)染(ran)源(yuan)應(ying)及(ji)時(shi)采(cai)取(qu)措(cuo)施(shi)處(chu)理(li)。對(dui)於(yu)汙(wu)染(ran)的(de)雜(za)交(jiao)瘤(liu)細(xi)胞(bao)可(ke)以(yi)采(cai)取(qu)生(sheng)物(wu)學(xue)的(de)過(guo)濾(lv)方(fang)法(fa)，將(jiang)汙(wu)染(ran)的(de)雜(za)交(jiao)瘤(liu)細(xi)胞(bao)注(zhu)射(she)於(yu)BALB／c小鼠的腹腔，待長出腹水或實體瘤時，犖^菌取出分離雜交瘤細胞，一般可除去支原體汙染。

　　2.　融合後雜交瘤不生長：在保證融合技術沒有問題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時間過長。②牛血清的質量太差，用前沒有進行嚴格的篩選。③骨髓瘤細胞汙染了支原體。④HAT有問題
，主要是A含量過高或HT含量不足。

　　3.　雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體

　　①　融合後有細胞生長，但無抗體產生
，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細胞發生突變，變成A抵抗細胞所致。

　　②　有可能是免疫原抗原性弱
，免疫效果不好。

　　③　對dui於yu原yuan分fen泌mi抗kang體ti的de雜za交jiao瘤liu細xi胞bao變bian為wei陰yin性xing，可ke能neng是shi細xi胞bao支zhi原yuan體ti汙wu染ran

，或huo非fei抗kang體ti分fen泌mi細xi胞bao克ke隆long競jing爭zheng性xing生sheng長chang，從cong而er抑yi製zhi了le抗kang體ti分fen泌mi細xi胞bao的de生sheng長chang。也ye可ke能neng發fa生sheng染ran色se體ti丟diu失shi。Goding91982曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

　　三要:

　　要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。

　　要應用倒置顯微鏡經常檢查細胞的生長狀況。

　　要定期進行再克隆。

　　三不要:

　　不要讓細胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細胞將成為優勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細胞。

　　不要讓培養物不加檢查地任其連續培養幾周或幾個月。

　　不要不經克隆化而使雜交瘤在機體內以腫瘤生長形式連續傳好幾代。

　　4.　雜交瘤細胞難以克隆化

　　可能與小牛血清質量
、雜交瘤細胞的活性狀態有關，或由於細胞有支原體汙染，使克隆化難以成功。若是融合後的早期克隆化，應在培養液加HT。

 

 

抗體的製備方法與原理

一、抗血清的製備

　　有了質量好的抗原
，還必須選擇適當的免疫途徑，才能產生質量好（特異性強和效價高）的抗體。

　　（一）用於免疫的動物

　　作免疫用的動物有哺乳類和禽類

，主要為羊、馬

、家兔、猴、豬、豚鼠
、雞等，實驗室常用者為家兔
、山羊和豚鼠等。動物種類的選擇主要根據抗原的生物學特性和所要獲得抗血清數量，如一般製備抗r-mianyiqiudanbaikangxueqing，duoyongjiatuheshanyang，yindongwufanyinglianghao，erqienenggoutigongzugoushuliangdexueqing，yongyumianyidedongwuyingshiling，jianzhuang，wuganranxingjihuan，zuihaowei///雄(xiong)性(xing)，此(ci)外(wai)還(hai)需(xu)十(shi)分(fen)注(zhu)意(yi)動(dong)物(wu)的(de)飼(si)養(yang)
，以(yi)消(xiao)除(chu)動(dong)物(wu)的(de)個(ge)體(ti)差(cha)異(yi)以(yi)及(ji)在(zai)免(mian)疫(yi)過(guo)程(cheng)中(zhong)死(si)亡(wang)的(de)影(ying)響(xiang)。若(ruo)用(yong)兔(tu)，最(zui)好(hao)用(yong)純(chun)種(zhong)新(xin)西(xi)蘭(lan)兔(tu)
，一(yi)組(zu)三(san)隻(zhi)，兔(tu)的(de)體(ti)重(zhong)以(yi)2～3kg為宜。

　　（二）免疫途徑

　　免疫途徑有多種多樣，如靜脈內、腹腔內
、肌肉內、皮內
、皮下、淋巴結內注射等
，一般常用皮下或背部多點皮內注射，每點注射0.1ml左右。途徑的選擇決定於抗原的生物學特性和理化特性，如激素、酶
、毒素等生物學活性抗原
，一般不宜采用靜脈注射。

　　（三）佐劑

　　youyubutonggetiduitongyikangyuandefanyingxingbutong，erqiebutongkangyuanchanshengmianyifanyingdenengliyeyouqiangyouruo
，yincichangchangzaizhushekangyuandetongshi，jiarunengzengqiangkangyuandekangyuanxingwuzhi，yicijijitichanshengjiaoqiangdemianyifanying，zhezhongwuzhichengweimianyizuoji。

　　佐(zuo)劑(ji)除(chu)了(le)延(yan)長(chang)抗(kang)原(yuan)在(zai)體(ti)內(nei)的(de)存(cun)留(liu)時(shi)間(jian)，增(zeng)加(jia)抗(kang)原(yuan)刺(ci)激(ji)作(zuo)用(yong)外(wai)，更(geng)主(zhu)要(yao)的(de)是(shi)

，它(ta)能(neng)刺(ci)激(ji)網(wang)狀(zhuang)內(nei)皮(pi)係(xi)統(tong)
，使(shi)參(can)與(yu)免(mian)疫(yi)反(fan)應(ying)的(de)免(mian)疫(yi)活(huo)性(xing)細(xi)胞(bao)增(zeng)多(duo)
，促(cu)進(jin)T細胞與B細胞的相互作用，從而增強機體對抗原的細胞免疫和抗體的產生。

　　常用的佐劑是福氏佐劑（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調整為1：2～9（V/V），這是不完全福氏佐劑
，在每毫升不完全佐劑加入1～20mg卡介苗就成為完全佐劑。

　　配製方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內，用超聲波使之混勻，高壓滅菌
，置4℃下(xia)保(bao)存(cun)備(bei)用(yong)。免(mian)疫(yi)前(qian)取(qu)等(deng)容(rong)積(ji)完(wan)全(quan)或(huo)不(bu)完(wan)全(quan)佐(zuo)劑(ji)與(yu)免(mian)疫(yi)原(yuan)溶(rong)液(ye)混(hun)合(he)
，用(yong)振(zhen)蕩(dang)器(qi)混(hun)勻(yun)成(cheng)乳(ru)狀(zhuang)，也(ye)可(ke)以(yi)在(zai)免(mian)疫(yi)前(qian)取(qu)需(xu)要(yao)量(liang)佐(zuo)劑(ji)置(zhi)乳(ru)缽(bo)中(zhong)研(yan)磨(mo)，均(jun)勻(yun)後(hou)再(zai)邊(bian)磨(mo)邊(bian)滴(di)加(jia)入(ru)等(deng)容(rong)積(ji)抗(kang)原(yuan)液(ye)（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完後再繼續研磨成乳劑，滴於冰水上5～10min內nei完wan全quan不bu擴kuo散san為wei止zhi。為wei避bi免mian損sun失shi抗kang原yuan，亦yi可ke用yong一yi注zhu射she器qi裝zhuang抗kang原yuan液ye，另ling一yi注zhu射she器qi裝zhuang佐zuo劑ji

，二er者zhe以yi聚ju乙yi烯xi塑su料liao管guan連lian接jie
，然ran後hou二er者zhe來lai回hui反fan複fu抽chou吸xi
，約yue數shu十shi分fen鍾zhong後hou即ji能neng完wan全quan乳ru化hua。檢jian查zha合he格ge後hou即ji以yi其qi中zhong一yi注zhu射she器qi作zuo注zhu射she用yong。

　　（四）免疫方法

　　抗原劑量，首次劑量為300～500μg，加強免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右。每2～3周加強免疫一次。加強免疫時用不完全佐劑，首次免疫時皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加強免疫時不必注射百日咳疫苗。

　　在第2次加強免疫後2周
，從耳緣靜脈取2～3ml血，製備血清，檢測抗體效價（見後）。如未達到預期效價，需再進行加強免疫
，直到滿意時為止（圖2-3）。當抗體效價達到預期水平時，即可放血製備抗血清。

 

圖2-3 抗體反應

　　（五）抗血清的采集與保存

　　家兔是最常用以產生抗體的動物

，因此這裏主要討論兔血的收集。羊等較大動物以頸靜脈、dongmaiquxue，shudengxiaodongwuquxuekecanyueyouguanziliao。qutuxueyouliangzhongfangfa
，yishieryuanjingmaihuoerdongmaifangxue

，yishijingdongmairuxue，yekexinzangcaixue。qudongmaihuojingmaifangxueshi，jiangtufangruyigetezaodemuxiahuolongnei，erluyuxiang（籠）外
，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯塗抹耳廓，30s後，耳血管擴張、充血。用手輕拉耳尖
，以單麵剃須刀或尖的手術刀片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然ran後hou用yong棉mian球qiu壓ya迫po止zhi血xue
，凝ning血xue後hou洗xi去qu二er甲jia苯ben。二er星xing期qi後hou，可ke在zai另ling一yi耳er放fang血xue。此ci法fa可ke反fan複fu多duo次ci放fang血xue。頸jing動dong脈mai放fang血xue時shi，將jiang兔tu仰yang臥wo，固gu定ding於yu兔tu台tai，剪jian去qu頸jing部bu的de毛mao，切qie開kai皮pi膚fu

，暴bao露lu頸jing動dong脈mai
，插cha管guan，放fang血xue。放fang血xue過guo程cheng中zhong要yao嚴yan格ge按an無wu菌jun要yao求qiu進jin行xing。

　　收集的血液置於室溫下1h左右
，凝固後
，置4℃下，過夜（切勿冰凍）析出血清

，離心，4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清
，分裝（0.05～0.2ml）
，貯於-40℃以下冰箱，或凍幹後貯存於4。C冰箱保存。

　　（六）抗血清質量的評價

　　在免疫期間，不僅各個不同的動物，而且同一動物在不同的時間內抗血清效價、特異性
、親合力等都可能發生變化，因而必須經常地采血測試。隻有在對抗血清的效價

、特異性
、親合力等方麵作徹底的評價後，才可使用所取得的抗血清。

　　1．效價 　抗血清的效價
，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產生的抗體，可用雙擴散等方法測定。前者測定的效價極為精確。而後者則粗糙得多。

　　（1）放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優質標記抗原混合，孵育24h後，測定其結合率。通常以結合率為50%的血清稀度和為效價。如某抗血清的結合率為50%時的稀釋度為1：15000，則該血清的效價就是1：15000。抗血清的效價，除由抗血清本身的性質決定外，還受標記抗原的質量、孵育時間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響


，在工作中必須引起注意。（測定方法見第8章　）

　　（2）雙向擴散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴散，兩者在相交處產生沉澱線
，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。

　　球脂板的製備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩衝液加到15g的瓊脂內，於水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解
，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時，加入疊氮鈉（NaN3）
，使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在幹淨平皿或玻片上
，約3mm厚
，待其冷卻，完全凝固後，用打孔器打孔（圖2-4）。中央孔內加適量抗原（容量為50μl），周圍各孔內分別加入50μl 1：2、1：4
、1：8
、1：16
、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無沉澱線產生，以判斷血清的稀釋度（圖2-5）。

 

圖2-4 雙向擴散模型

 

圖2-5 免疫擴散試驗

　　2．特異性測定 　　kangxueqingdeteyixinghuochengzhuanyixingshizhikangxueqingduixiangyingdekangyuanjijinsidekangyuanwuzhideshibienengli。teyixinghaojiushikangxueqingdeshibienengliqiang。tongchang，teyixingshiyijiaochafanyinglvlaibiaoshide。jiaochafanyinglvdi，biaoshikangxueqingdeteyixinghao，fanzhizeteyixingcha。jiaochafanyinglvyibanshiyongjingzhengyizhiquxianlaipanduande。yibutongnongdudekangyuanhejinsikangyuanwuzhifenbiezuojingzhengyizhiquxian，jisuangezidejiehelv（B/T或B/B0），求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應率。

　　S=y/Z×100%

　　S：交叉反應率
，y：IC50時抗原濃度
，Z：IC50時近似抗原物質的濃度。

　　如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質IC50濃度幾乎是無限大
，可以說這一抗血清與其它抗原物質的交叉反應率近似零
，即無交叉反應，該抗血清的特異性是好的。

　　3．親合力 　　在免疫學中， 親(qin)合(he)力(li)是(shi)指(zhi)抗(kang)體(ti)與(yu)結(jie)合(he)抗(kang)原(yuan)體(ti)的(de)活(huo)度(du)或(huo)牢(lao)固(gu)度(du)。抗(kang)體(ti)與(yu)抗(kang)原(yuan)結(jie)合(he)疏(shu)鬆(song)，結(jie)合(he)後(hou)會(hui)迅(xun)速(su)解(jie)離(li)，稱(cheng)為(wei)親(qin)合(he)力(li)低(di)，反(fan)之(zhi)，親(qin)合(he)力(li)高(gao)。親(qin)合(he)力(li)的(de)高(gao)低(di)是(shi)由(you)抗(kang)原(yuan)分(fen)子(zi)的(de)大(da)小(xiao)

，抗(kang)體(ti)分(fen)子(zi)的(de)結(jie)合(he)位(wei)點(dian)與(yu)抗(kang)原(yuan)的(de)決(jue)定(ding)基(ji)之(zhi)間(jian)的(de)立(li)體(ti)結(jie)構(gou)型(xing)的(de)合(he)適(shi)程(cheng)度(du)決(jue)定(ding)的(de)。親(qin)合(he)力(li)常(chang)以(yi)親(qin)合(he)常(chang)數(shu)K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達到的最小檢出量（靈敏度）的倒數，K=1/[H]，[H]是最小檢出量，通常
，K的範圍在108～1012L/mol之間，也有高達1014L/mol的。

　　計算親合常數的方法20餘種，計算出的K都不能真實反映實驗情況
，隻能作為參考。

　　（七）免疫失敗的可能原因及應采取的措施

　　有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方麵找原因，並改進之。

　　（1）免疫動物的種屬及品係是否合適
，可考慮改變動物的種屬或品係，或擴大免疫動物的數量。

　　（2）抗原質量是否良好
，可改用其它廠家的產品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結構，或改進提取方法。

　　（3）製備的免疫原是否符合要求
，可從偶聯劑，載體、抗原或載體的比例
、反應時間等多方麵去考慮，並加以改進。

　　（4）所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑
，或加強乳化。

　　（5）免疫的方法、劑量

，加強免疫的間隔時間和次數，免疫的途徑是否合適。

　　（6）動物的飼養是否得當

，如營養（飼料、飲水）、環境衛生（通風

、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。

　　二、單克隆抗體的製備

　　1975年Kohler和Milstein發fa現xian將jiang小xiao鼠shu骨gu髓sui瘤liu細xi胞bao與yu和he綿mian羊yang紅hong細xi胞bao免mian疫yi的de小xiao鼠shu脾pi細xi胞bao進jin行xing融rong合he
，形xing成cheng的de雜za交jiao瘤liu細xi胞bao既ji可ke產chan生sheng抗kang體ti
，又you可ke無wu性xing繁fan殖zhi
，從cong而er創chuang立li了le單dan克ke隆long抗kang體ti雜za交jiao瘤liu技ji術shu。這zhe一yi技ji術shu上shang的de突tu破po使shi血xue清qing學xue的de研yan究jiu進jin入ru了le一yi個ge高gao度du精jing確que的de新xin紀ji元yuan。

　　免疫細胞化學的 技術關鍵之一是製備特異性強


、親合力大、滴di度du高gao的de特te異yi性xing抗kang體ti
，由you於yu每mei種zhong抗kang原yuan都dou有you幾ji個ge抗kang原yuan決jue定ding簇cu，用yong它ta免mian疫yi動dong物wu將jiang產chan生sheng對dui各ge個ge決jue定ding簇cu的de抗kang體ti，即ji多duo克ke隆long抗kang體ti。單dan克ke隆long抗kang體ti則ze是shi由you一yi個ge產chan生sheng抗kang體ti的de細xi胞bao與yu一yi個ge骨gu髓sui瘤liu細xi胞bao融rong合he而er形xing成cheng的de雜za交jiao廇廇細xi胞bao經jing無wu性xing繁fan殖zhi而er來lai的de細xi胞bao群qun所suo產chan生sheng的de，所suo以yi它ta的de免mian疫yi球qiu蛋dan白bai屬shu同tong一yi類lei型xing，質zhi地di純chun一yi
，而er且qie它ta是shi針zhen對dui某mou一yi抗kang原yuan決jue定ding簇cu的de，因yin此ci特te異yi性xing強qiang，親qin合he性xing也ye一yi致zhi。單dan克ke隆long抗kang體ti（McAb）的特性和常規血清抗體的特性比較見2-3。

表2—3 單克隆抗體（McAb）和常規免疫血清抗體的特性比較

　　單克隆抗體的製備方法如下。

　　（一）動物的選擇與免疫

　　1．動物的選擇 　純種BALB/Cxiaoshu
，jiaowenshun
，liwodehuodongfanweixiao，tiruo
，shiliangjipaiwujiaoxiao，yibanhuanjingjiejingdeshiyanshijunnengsiyangchenghuo。muqiankaizhanzajiaoliujishudeshiyanshiduoxuanyongchunzhongBALA/C小鼠。

　　2．免疫方案 　　選擇合適的免疫方案對於細胞融合雜交的成功
，獲得高質量的McAb至關重要。一般在融合前兩個月左右根據確立免疫方案開始初次免疫
，免疫方案應根據抗原的特性不同而定。

　　（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應先製備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。

　　初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內注射（一般0.8～1ml,0.2ml/點）

　　↓3周後

　　第二次免疫 劑量同上
，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）

　　↓3周後

　　第三次免疫 劑量同一，不加佐劑
，ip（5～7天後采血測其效價）

　　↓2～3周

　　加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內注射）

　　↓3天後

　　取脾融合

　　目前，用於可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方麵增強了抗原的免疫原性
，另一方麵可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎免疫可直接采用脾內注射。③使用細胞因子作為佐劑
，提高機體的免疫應答水平
，增強免疫細胞對抗原的反應性。

　　（2）顆粒抗原免疫性強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×107個細胞。

　　初次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓2～3周後

　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓3周後

　　加強免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv

　　↓

　　取脾融合

　　（二）細胞融合

　　1．細胞融合前準備

　　（1）骨髓瘤細胞係的選擇：骨髓瘤細胞應和免疫動物屬於同一品係，這樣雜交融合率高，也便於接種雜交瘤在同一品係小鼠腹腔內產生大量McAb。常用的骨髓瘤細胞係見表2-4。

表2-4用於融合試驗的主要骨髓瘤細胞係

　　骨髓瘤細胞的培養可用一般的培養液
，如RPMI1640，DMEM培養基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當細胞處於對數生長的中期時
，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現象
，應定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。

　　（2）飼養細胞：zaizuzhipeiyangzhong，dangehuoshaoshufensandexibaobuyishengchangfanzhi，ruojiaruqitahuoxibao
，zekecujinzhexiexibaoshengchangfanzhi，suojiarudezhezhongxibaoshubeichengweisiyangxibao。zaizhibeiMcAb的過程中
，許多環節　需要加飼養細胞，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養過程中
，加入飼養細胞是十分必要的。常用的飼養細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）
、小鼠脾髒細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞係3T3經放射線照射後作為飼養細胞。飼養細胞的量為一般為2×104或105細胞/孔。

　　2．細胞融合的步驟

　　（1）製備飼養細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。

　　與免疫小鼠相同品係的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周

↓

　　拉頸 處死，浸泡在75%酒精內，3～5min

　　↓

　　用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜

　　↓

　　用無菌注射器注入5～6ml預冷的培養液（嚴禁刺破腸管）

　　↓

　　反複衝洗
，吸出衝洗液

　　↓

　　衝洗液放入10ml離心管

，1200rpm/分離5～6min

　　↓

　　用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養液混懸，調整細胞數至1×105/ml

　　↓

　　加入96孔板，100μl/孔

　　↓

　　放入37。c CO2孵箱培養

　　（2）製備免疫脾細胞

　　最後一次加強免疫3天後小鼠拉頸處死

　　↓

　　無菌取脾髒，培養液洗 一次

　　↓

　　脾髒研碎，過不鏽鋼篩網

　　↓

　　離心，細胞用培養液洗2次

　　↓

　　計數

　　↓

　　取108脾淋巴細胞懸液備用

　　（3）製備骨髓瘤細胞

　　取對數生長骨髓瘤細胞離心

　　↓

　　用無血清培養液洗2次

　　↓

　　計數
，取得×107細胞備用

　　（4）融合

　　①將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清
，用吸管吸淨殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉澱略鬆動。

　　②90s內加入37℃預溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液
，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。

　　③加37。C預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml
、3ml、4ml、5ml和6ml。

　　④離心，800rpm, 6min。

　　⑤充上清

，用含20%小牛血清HAT選擇培養液重懸。

　　⑥將上述細胞
，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100μl。一般一個免疫脾髒可接種4塊96孔板。

　　⑦將培養板置37℃

、5%CO2培養箱中培養。

　　（三）選擇雜交瘤細胞及抗體檢測

　　1．HAT選擇雜交瘤細胞　　　脾細胞和骨髓瘤細胞經PEG處理後，形成多種細胞的混合體，隻有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在HAT選xuan擇ze培pei養yang液ye中zhong培pei養yang時shi，由you於yu骨gu髓sui瘤liu細xi胞bao缺que乏fa胸xiong苷gan激ji酶mei或huo次ci黃huang嘌piao呤ling鳥niao嘌piao呤ling核he糖tang轉zhuan移yi酶mei
，故gu不bu能neng生sheng長chang繁fan殖zhi

，而er雜za交jiao瘤liu細xi胞bao具ju有you上shang述shu兩liang種zhong酶mei
，在zaiHAT選擇培養液可以生長繁殖。

　　在用HAT選擇培養1～2天內，將有大量瘤細胞死亡，3～4天後瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養液維持7～10天後應換用HT培養液
，再維持2周，改用一般培養液。在上述選擇培養期間
，雜交瘤細胞布滿孔底1/10麵積時
，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞係。在選擇培養期間，一般每2～3天換一半培養液。

　　2．抗體的檢測　　 檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法
，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。

　　常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用於可溶性抗原
、細胞McAb的檢測。（2）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）可用於可溶性抗原、細胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合於細胞表麵抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉粘附雙層吸附試驗等。

　　（四）雜交瘤的克隆化

　　雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經過HAT篩選後的雜交瘤克隆不能保證一個孔內隻有一個克隆。在實際工作中
，可能會有數個甚至更多的克隆
，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、所需要的抗體（特異性抗體）fenmixibaoheqitawuguankangtidefenmixibao。yaoxiangjiangzhexiexibaobicifenkaijiuxuyaokelonghua。kelonghuadeyuanzeshi，duiyujiancekangtiyangxingdezajiaokelongjinzaojinxingkelonghua，fouzekangtifenmidexibaohuibeikangtifeifenmidexibaosuoyizhi，yinweikangtifeifenmixibaodeshengchangsudubikangtifenmidexibaoshengchangsudukuai，erzhejingzhengdejieguohuishikangtifenmidexibaodiushi。jishikelonghuaguodezajiaoliuxibaoyexuyaodingqidezaikelong，yifangzhizajiaoliuxibaodetubianhuoransetidiushi，congersangshichanshengkangtidenengli。

　　克隆化的方法很多
，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。

　　1．有限稀釋法克隆

　　（1）克隆前1天製備飼養細胞層（同細胞融合）。

　　2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養孔內輕輕吹幹
，計數。

　　（3）調整細胞為3～10個細胞/ml。

　　（4）取頭天準備的飼養細胞層的細胞培養板，每孔加入稀釋細胞100μl。孵育於37℃、5%CO2孵箱中。

　　（5）在第7天換液，以後每2～3天換液1次。

　　（6）8～9天可見 細胞克隆形成
，及時檢測抗體活性。

　　（7）將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養。

　　（8）每個克隆應盡快凍存。

　　2．軟瓊脂培養法克隆

　　（1）軟瓊脂的配製：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。

　　①1%瓊脂水溶液：高壓滅菌
，42℃預熱。

　　②0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配製而成。置42℃保溫。

　　（2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養細胞）15ml傾注於直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固後作為基底層備用。

　　（3）按100/ml
，500/ml或5000/ml等濃度配製需克隆的細胞懸液。

　　（4）1ml 0.5%瓊脂液（42℃預熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。

　　（5）混勻後立傾注於瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育於37℃、5%CO2孵箱中。

　　（6）4～5天 後即可見針尖大小白色克隆，7～10天後，直接移種至含飼養細胞的24孔中進行培養。

　　（7）檢測抗體，擴大培養，必要是地再克隆化。

　　（五）雜交瘤細胞的凍存與複蘇

　　1．雜交瘤細胞的凍存　　 及時凍存原始孔的雜交瘤細胞每(mei)次(ci)克(ke)隆(long)化(hua)得(de)到(dao)的(de)亞(ya)克(ke)隆(long)細(xi)胞(bao)是(shi)十(shi)分(fen)重(zhong)要(yao)的(de)。因(yin)為(wei)在(zai)沒(mei)有(you)建(jian)立(li)一(yi)個(ge)穩(wen)定(ding)分(fen)泌(mi)抗(kang)體(ti)的(de)細(xi)胞(bao)係(xi)的(de)時(shi)候(hou)，細(xi)胞(bao)的(de)培(pei)養(yang)過(guo)程(cheng)中(zhong)隨(sui)時(shi)可(ke)能(neng)發(fa)生(sheng)細(xi)胞(bao)的(de)汙(wu)染(ran)


、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。

　　雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞係的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養環境不同而改變，在24孔培養板中培養，當長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。

　　細胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養液；10%DMSO（二甲基亞碸）。

　　凍存液最好預冷

，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃後放入-70℃超chao低di溫wen冰bing箱xiang，次ci日ri轉zhuan入ru液ye氮dan中zhong。也ye可ke用yong細xi胞bao凍dong存cun裝zhuang置zhi進jin行xing凍dong存cun。凍dong存cun細xi胞bao要yao定ding期qi複fu蘇su，檢jian查zha細xi胞bao的de活huo性xing和he分fen泌mi抗kang體ti的de穩wen定ding性xing
，在zai液ye氮dan中zhong細xi胞bao可ke保bao存cun數shu年nian或huo更geng長chang時shi間jian。

　　2．細胞複蘇方法 　將玻璃安瓿自液氮中小心取出
，放37℃水浴中，在1min內使凍存的細胞解凍
，將細胞用完全培養液洗滌兩次，然後移入頭天已製備好的飼養層細胞的培養瓶內，置37℃、5%CO2孵箱中培養，當細胞形成集落時
，檢測抗體活性。

　　（六）單克隆抗體的大量生產

　　大量生產單克隆抗體的方法主要有兩種：

　　（1）體外使用旋轉培養管大量培養雜交瘤細胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產量低，一般培養液內抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產，費用較高。

　　（2）體內接種雜交瘤細胞
，製備腹水或血清。

　　①實體瘤法：對數生長期的雜交瘤細胞按1～3×107/ml接種於小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點。待腫瘤達到一定大小後（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達到1～10mg/ml。但采血量有限。

　　②腹水的製備：常規是先腹腔注射0.5ml Pristane 降植烷或液體石蠟於BALB/C鼠

，1～2周後腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天tian後hou可ke產chan生sheng腹fu水shui，密mi切qie觀guan察cha動dong物wu的de健jian康kang狀zhuang況kuang與yu腹fu水shui征zheng象xiang
，待dai腹fu水shui盡jin可ke能neng多duo
，而er小xiao鼠shu頻pin於yu死si亡wang之zhi前qian，處chu死si小xiao鼠shu，用yong滴di管guan將jiang腹fu水shui吸xi入ru試shi管guan中zhong，一yi般ban一yi隻zhi小xiao鼠shu可ke獲huo5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反複收集數次。腹水中單克隆抗體含量可達到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法
，還可將腹水中細胞凍存起來，複蘇後轉種小鼠腹腔則產生腹水塊、量多。

　　（七）單克隆抗體的鑒定

　　對製備的McAb進行係統的鑒定是十分必要的，應做下述幾個方麵的鑒定：

　　1．抗體特異性的鑒定 　　除用免疫原（抗原）進行抗體的檢測外，還應該用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA
、IFA法。例如：①製備抗黑色素瘤細胞的McAb，chuyongheisesuliuxibaofanyingwai
，haiyinggaiyongqitazangqidezhongliuxibaohezhengchangxibaojinxingjiaochafanying，yibiantiaoxuanzhongliuteyixinghuozhongliuxiangguankangyuandedankelongkangti。②製備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應，其次是與其它細胞因子間有無交叉。

　　2．McAb的Ig類與亞類的鑒定　　一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時已經基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至於亞類則需要用標準抗亞類血清係統作雙擴或夾心ELISA來確定。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG（3%），更有利於沉澱線的形成。

　　3．McAb中和活性的鑒定　　　用動物或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如
，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種於易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。

　　4．McAb識別抗原表位的鑒定　　用競爭結合試驗，測相加指數的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。

5．McAb親合力的鑒定　 用ELISA或RIA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親合力。

 

ELISA

ELISA是酶聯接免疫吸附劑測定 Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay 的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術之後發展起來的一種免疫酶技術。此項技術自70年代初問世以來
，發展十分迅速，目前已被廣泛用於生物學和醫學科學的許多領域。

　　一　原理

　　ELISA是以免疫學反應為基礎
，將抗原、牽9體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由於抗原
、抗體的反應在一種固相載體──jubenyixiweiliangdidingbandekongzhongjinxing
，meijiaruyizhongshijifuyuhou
，ketongguoxidichuquduoyudeyoulifanyingwu
，congerbaozhengshiyanjieguodeteyixingyuwendingxing。zaishijiyingyongzhong，tongguobutongdesheji，jutidefangfabuzhoukeyouduozhong。ji:用於檢測抗體的間接法圖a、用於檢測抗原的雙抗體夾心法圖b以及用於檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

　　二　操作步驟

　　方法一　用於檢測未知抗原的雙抗體夾心法:

　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩衝液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml

，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液
，用洗滌緩衝液洗3次

，每次3分鍾。簡稱洗滌，下同。

　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然後洗滌。同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔。

　　3.　加酶標抗體：於各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體經滴定後的稀釋度0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。

　　4.　加底物液顯色：於各反應孔中加入臨時配製的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鍾。

　　5.　終止反應：於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　結果判定：可於白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺
，依據所呈顏色的深淺
，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上

，於450nm若以ABTS顯色
，則410nm處
，以空白對照孔調零後測各孔O·D值，若大於規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

　　方法二　用於檢測未知抗體的間接法：

　　　　　　用包被緩衝液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，
每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　加一定稀釋的待檢樣品未知抗體0.1ml於上述已包被之反應孔
中,置37℃孵育1小時,洗滌。同時做空白、陰性及陽性孔對照

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　於反應孔中
，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體抗抗體0.1ml，
37℃孵育30-60分鍾
，洗滌,最後一遍用DDW洗滌。

　　　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　其餘步驟同“雙抗體夾心法”的4、5
、6。

　　三　試劑器材

　　1.　試劑

　　1　包被緩衝液PH9.6 0.05M碳酸鹽緩衝液:

　　　　　　Na?CO３　　　　1.59克

　　　　　　NaHCO３　 2.93克

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

　　2　洗滌緩衝液PH7.4 PBS：0.15M

　　　　　　KH2PO4 　　　　　0.2克

　　　　　　Na2HPO４·12H2O　　2.9克

　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克

　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克

　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml

　　　　　　加蒸餾水至1000ml

　　3　稀釋液：

　　　　　　　牛血清白蛋白BSA 0.1克

2.　器材:

　　1　聚苯乙烯塑料板簡稱酶標板40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾
，洗滌瓶。

　　2　小燒杯
、玻璃棒
、試管、吸管和量筒等。

　　3　4℃冰箱
，37℃孵育箱。

　　四　注意事項

　　1.　正zheng式shi試shi驗yan時shi，應ying分fen別bie以yi陽yang性xing對dui照zhao與yu陰yin性xing對dui照zhao控kong製zhi試shi驗yan條tiao件jian，待dai檢jian樣yang品pin應ying作zuo一yi式shi二er份fen，以yi保bao證zheng實shi驗yan結jie果guo的de準zhun確que性xing。有you時shi本ben底di較jiao高gao
，說shuo明ming有you非fei特te異yi性xing反fan應ying，可ke采cai用yong羊yang血xue清qing、兔血清或BSA等封閉。

　　2.　在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

　　1　固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被
，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。

　　（2 包被抗體或抗原的選擇：將抗體或抗原吸附在固相載體表麵時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度0.1
、1.0和10μg／ml等進行包被後
，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對於多數蛋白質來說通常為1～10μg／ml。

　　3　酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定見酶標記抗體部份。然後再固定其它條件或采取“方陣法”包被物
、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度在正式實驗係統裏準確地滴定其工作濃度。

4   酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體如OPD等有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌
、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間後，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鍾為宜。底物使用液必須新鮮配製，尤其是H2O2在臨用前加入。

 

 

免疫組化染色方法

 

SP法
1）脫蠟
、水化；
2）PBS洗2～3次各5分鍾；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鍾；
4）PBS洗2～3次各5分鍾； 5）抗原修複
；
6）PBS洗2～3次各5分鍾
；
7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鍾。甩去多餘液體。
8）滴加Ⅰ抗50μl
，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。
9）4℃過夜後需在37℃複溫45分鍾。
10）PBS洗3次各5分鍾；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置
，或37℃1小時；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS洗3次各5分鍾；
14）DAB顯色5～10分鍾，在顯微鏡下掌握染色程度；
15）PBS或自來水衝洗10分鍾
；
16）蘇木精複染2分鍾，鹽酸酒精分化；
17）自來水衝洗10～15分鍾；
18）脫水、透明、封片、鏡檢。

 

SABC法
1脫蠟

、水化。
2PBS洗兩次各5分鍾。
3用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鍾，蒸餾水洗3次。
4抗原修複。
5PBS洗5分鍾。 
6滴加正常山羊血清封閉液
，室溫20分鍾。甩去多餘液體。
7滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜後在37℃複溫45分鍾）。
8PBS洗三次每次2分鍾。
9滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鍾。
10PBC洗3次每次2分鍾。
11滴加試劑SABC
，20℃～37℃20分鍾。

12PBS洗4次每次5分鍾。
13DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。
14蒸餾水洗。蘇木素複染2分鍾、鹽酸酒精分化。 
15脫水、透明、封片、鏡檢。

 

 

常用抗原修複方法

 

用於福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片：

 

1）抗原熱修複  可根據實驗室的具體條件
，選用微波爐抗原修複
、高壓鍋抗原修複或水浴高溫抗原修複。抗原熱修複可選用各種緩衝液
，如TBS
、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明

，以0.01M枸櫞酸鹽緩衝液（pH6.0）效果最好。請選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩衝液（粉劑）配製，取該粉劑一包溶於1000ml的蒸餾水中，混勻
，其pH值在6.0 ± 0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調整。
（1）高壓熱修複  切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的0.01M枸櫞酸鈉緩衝溶液（pH6.0，工作液）或0.001M EDTA（pH8.0）注入不鏽鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置於金屬架上

，放入鍋內，使切片位於液麵以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱5~6分鍾後）
，計時1~2分鍾，然後將壓力鍋端離熱源

，冷水衝至室溫後
，取下氣閥
，打開鍋蓋，取出切片
，蒸餾水洗後，PBS洗2分鍾×3，下接免疫組化染色步驟。

（2）煮沸熱修複  切片脫蠟至水後，放入盛有0.01M枸櫞酸鈉緩衝溶液（pH6.0，工作液）的容器中，並將此容器置於盛有一定數量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸
，從小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20分鍾
，然後端離電爐，室溫冷卻20~30分鍾，蒸餾水衝洗，PBS洗，

（3）微波熱修複。切片脫蠟至水後，3％H2O2處理10分鍾，蒸餾水洗2分鍾×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩衝液（工作液）的容器中
，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間並持續10~15分鍾（注意：無論是使用醫用或家用微波爐，請根據具體機型酌情設置條件，務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20分鍾（注意：不可將切片從緩衝液中取出冷卻

，以便使蛋白能夠恢複原有的空間構型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。適用的抗原有：AR，Bax
，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit
，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin
，ER
，Heat shock protein，HPV，Ki-67
，MDMZ，p53
，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC
，PR
，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

2）酶消化方法  常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃


，消化時間約為5~30分鍾（胰酶的最終濃度可以根據使用者的要求進行調整，濃度範圍可以從0.05%至0.25%）； 胃蛋白酶消化37℃時間為30分鍾。皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10mg/ml的saponin溶液

，消化時間為室溫孵育30分鍾。 適用於被固定遮避的抗原
，其中有：Collagen，Complement

，Cytokeratin
，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。