一、試劑/溶劑
高效液相色譜法中，常用的試劑主要是有機溶劑、各(ge)種(zhong)鹽(yan)類(lei)及(ji)水(shui)。有(you)機(ji)溶(rong)劑(ji)一(yi)般(ban)多(duo)為(wei)購(gou)買(mai)的(de)色(se)譜(pu)級(ji)，所(suo)以(yi)出(chu)現(xian)問(wen)題(ti)的(de)幾(ji)率(lv)較(jiao)小(xiao)。但(dan)是(shi)分(fen)裝(zhuang)出(chu)的(de)有(you)機(ji)溶(rong)劑(ji)，由(you)於(yu)多(duo)次(ci)使(shi)用(yong)，被(bei)汙(wu)染(ran)的(de)概(gai)率(lv)較(jiao)大(da)，因(yin)此(ci)引(yin)入(ru)幹(gan)擾(rao)峰(feng)的(de)幾(ji)率(lv)較(jiao)高(gao)。
其qi次ci是shi水shui，水shui中zhong的de雜za質zhi是shi幹gan擾rao峰feng的de主zhu要yao來lai源yuan之zhi一yi，這zhe是shi大da家jia極ji易yi忽hu視shi的de問wen題ti。采cai集ji波bo長chang較jiao低di的de檢jian測ce方fang法fa，建jian議yi使shi用yong高gao品pin質zhi水shui，這zhe樣yang可ke以yi避bi免mian很hen多duo因yin為wei水shui質zhi帶dai來lai的de問wen題ti。再zai次ci是shi各ge種zhong鹽yan類lei，這zhe也ye是shi色se譜pu幹gan擾rao峰feng的de主zhu要yao來lai源yuan之zhi一yi。如ru圖tu2所示，與圖1相比，如圖2加入磷酸二氫鉀後，16.5min處(chu)出(chu)現(xian)幹(gan)擾(rao)峰(feng)。對(dui)於(yu)無(wu)機(ji)鹽(yan)引(yin)入(ru)的(de)幹(gan)擾(rao)峰(feng)，在(zai)方(fang)法(fa)開(kai)發(fa)初(chu)期(qi)一(yi)般(ban)就(jiu)會(hui)特(te)別(bie)關(guan)注(zhu)，尋(xun)找(zhao)解(jie)決(jue)方(fang)案(an)。方(fang)法(fa)確(que)定(ding)後(hou)，鹽(yan)的(de)品(pin)種(zhong)及(ji)級(ji)別(bie)也(ye)同(tong)時(shi)確(que)定(ding)，因(yin)此(ci)鹽(yan)對(dui)方(fang)法(fa)的(de)影(ying)響(xiang)基(ji)本(ben)可(ke)控(kong)。水和無機鹽引起的幹擾峰，比較快捷的解決方案是安裝鬼峰補集柱，這樣可以有效的避免此類幹擾。如果使用離子對試劑，則需選擇不影響離子對試劑的鬼峰補集柱。
二、器材
幹擾峰來源的第二個方麵是流動相配製及樣品前處理過程中接觸的各種器材。
首先是流動相配製過程中接觸的器材，包括燒杯、玻璃棒、pH計、濾杯、濾膜、流動相瓶等。燒杯、玻璃棒是配製流動相首先接觸的器材，因此建議配製流動相的燒杯、玻(bo)璃(li)棒(bang)專(zhuan)用(yong)。濾(lv)杯(bei)實(shi)驗(yan)人(ren)員(yuan)隻(zhi)要(yao)清(qing)洗(xi)幹(gan)淨(jing)一(yi)般(ban)不(bu)會(hui)帶(dai)來(lai)汙(wu)染(ran)。需(xu)要(yao)注(zhu)意(yi)的(de)是(shi)，如(ru)果(guo)過(guo)濾(lv)含(han)有(you)離(li)子(zi)對(dui)的(de)流(liu)動(dong)相(xiang)，建(jian)議(yi)增(zeng)加(jia)清(qing)洗(xi)次(ci)數(shu)，避(bi)免(mian)清(qing)洗(xi)不(bu)幹(gan)淨(jing)汙(wu)染(ran)後(hou)續(xu)流(liu)動(dong)相(xiang)。因(yin)此(ci)，對(dui)濾(lv)杯(bei)的(de)清(qing)洗(xi)應(ying)該(gai)建(jian)立(li)基(ji)本(ben)的(de)洗(xi)滌(di)規(gui)程(cheng)，保(bao)證(zheng)實(shi)驗(yan)人(ren)員(yuan)對(dui)使(shi)用(yong)的(de)器(qi)材(cai)清(qing)洗(xi)到(dao)位(wei)。濾(lv)膜(mo)也(ye)是(shi)幹(gan)擾(rao)峰(feng)引(yin)入(ru)源(yuan)頭(tou)之(zhi)一(yi)。
如圖3所suo示shi，乙yi腈jing經jing過guo有you機ji係xi濾lv膜mo過guo濾lv後hou，在zai梯ti度du洗xi脫tuo中zhong會hui引yin入ru較jiao大da幹gan擾rao峰feng。鑒jian於yu色se譜pu級ji試shi劑ji廠chang家jia已yi經jing過guo膜mo，且qie多duo數shu儀yi器qi都dou有you脫tuo氣qi機ji，所suo以yi筆bi者zhe建jian議yi無wu需xu再zai對dui甲jia醇chun、乙yi腈jing等deng純chun有you機ji相xiang過guo濾lv。流liu動dong相xiang瓶ping引yin入ru幹gan擾rao峰feng的de現xian象xiang主zhu要yao出chu現xian在zai夏xia季ji，這zhe是shi由you於yu夏xia季ji溫wen度du高gao，純chun水shui相xiang容rong易yi滋zi生sheng細xi菌jun。後hou續xu的de流liu動dong相xiang瓶ping使shi用yong人ren員yuan清qing洗xi不bu到dao位wei，所suo以yi導dao致zhi引yin入ru幹gan擾rao峰feng。因yin此ci流liu動dong相xiang瓶ping的de清qing洗xi要yao建jian立li嚴yan格ge的de洗xi滌di規gui程cheng。
再次樣品前處理過程中接觸的器材。前處理過程中接觸的器材主要包括容量瓶、濾頭、注射器及進樣瓶。容量瓶的清洗同流動相瓶、過濾裝置一樣，要建立良好的清洗規程。移液器材以及濾頭、注射器，多為塑料製品，其化學惰性較玻璃製品差，因此容易引入幹擾峰。如下圖4、圖5、圖6所示案例，此方法檢測波長為210納米，溶劑為正己烷-異丙醇（90:10），溶劑分別接觸移液槍槍頭、一次性吸管、一次性注射器後，均引入不同的幹擾峰。進樣小瓶若為一次性使用，一般不會引入幹擾峰。如果進樣瓶反複清洗，多次使用，則應建立清洗規程並對其清洗幹淨程度進行確認。
三、液相係統
yuqianliangleiganraofengxiangbi，yexiangxitongganraofengdejiejuegengjiakunnan。yexiangxitongshiyigedongtaiguocheng，suoyicileiwentijiejueguochenghaofeishijianchang，erqieyaoqiushiyanrenyuanyouhengaodesepusuyang。duicileiwentilaiyuanzhuyaoguijieweisanlei：強保留物質、離li子zi對dui汙wu染ran和he管guan路lu滋zi生sheng細xi菌jun。首shou先xian是shi強qiang保bao留liu物wu質zhi的de幹gan擾rao，其qi主zhu要yao特te征zheng是shi寬kuan峰feng。此ci類lei問wen題ti多duo數shu發fa生sheng在zai等deng度du洗xi脫tuo中zhong，梯ti度du洗xi脫tuo主zhu要yao出chu現xian在zai高gao比bi例li有you機ji相xiang處chu。這zhe是shi由you於yu強qiang保bao留liu物wu質zhi在zai當dang次ci進jin樣yang中zhong未wei洗xi脫tuo出chu，在zai後hou續xu進jin樣yang洗xi脫tuo出chu來lai所suo致zhi。如ru圖tu7中9分鍾處的色譜峰。對於此類幹擾峰，可通過延長采集時間或增加洗脫強度來消除對後續樣品的幹擾。係統幹擾峰第二個方麵是離子對、螯合劑這種難以洗脫的試劑對液相係統的汙染。此類汙染物多半是由於使用完畢含有離子對、螯ao合he劑ji之zhi類lei的de流liu動dong相xiang後hou，對dui係xi統tong的de衝chong洗xi不bu徹che底di所suo致zhi。此ci類lei汙wu染ran物wu主zhu要yao對dui一yi些xie采cai集ji波bo長chang較jiao低di的de方fang法fa產chan生sheng幹gan擾rao，普pu遍bian表biao現xian是shi基ji線xian噪zao音yin大da或huo者zhe幹gan擾rao峰feng，但dan隨sui著zhe方fang法fa的de運yun行xing會hui逐zhu漸jian趨qu於yu正zheng常chang。係(xi)統(tong)幹(gan)擾(rao)峰(feng)第(di)三(san)個(ge)方(fang)麵(mian)是(shi)係(xi)統(tong)滋(zi)生(sheng)細(xi)菌(jun)。對(dui)於(yu)係(xi)統(tong)滋(zi)生(sheng)細(xi)菌(jun)，多(duo)數(shu)讀(du)者(zhe)可(ke)能(neng)覺(jiao)得(de)不(bu)可(ke)思(si)議(yi)，因(yin)為(wei)液(ye)相(xiang)係(xi)統(tong)使(shi)用(yong)完(wan)畢(bi)都(dou)會(hui)用(yong)有(you)機(ji)相(xiang)衝(chong)洗(xi)保(bao)存(cun)。目(mu)前(qian)很(hen)多(duo)方(fang)法(fa)流(liu)動(dong)相(xiang)A都(dou)是(shi)水(shui)相(xiang)，雖(sui)然(ran)水(shui)相(xiang)每(mei)日(ri)都(dou)會(hui)新(xin)配(pei)製(zhi)，但(dan)如(ru)果(guo)由(you)濾(lv)頭(tou)到(dao)比(bi)例(li)閥(fa)這(zhe)一(yi)段(duan)管(guan)路(lu)長(chang)時(shi)間(jian)在(zai)水(shui)相(xiang)中(zhong)就(jiu)會(hui)滋(zi)生(sheng)細(xi)菌(jun)。隨(sui)著(zhe)時(shi)間(jian)的(de)運(yun)行(xing)，梯(ti)度(du)洗(xi)脫(tuo)中(zhong)會(hui)逐(zhu)漸(jian)的(de)產(chan)生(sheng)幹(gan)擾(rao)峰(feng)。此(ci)類(lei)問(wen)題(ti)雖(sui)然(ran)比(bi)較(jiao)隱(yin)蔽(bi)，但(dan)比(bi)較(jiao)容(rong)易(yi)解(jie)決(jue)，隻(zhi)要(yao)每(mei)日(ri)對(dui)放(fang)置(zhi)純(chun)水(shui)相(xiang)的(de)通(tong)道(dao)用(yong)有(you)機(ji)相(xiang)衝(chong)洗(xi)即(ji)可(ke)避(bi)免(mian)此(ci)類(lei)問(wen)題(ti)。實(shi)際(ji)工(gong)作(zuo)中(zhong)，色(se)譜(pu)工(gong)作(zuo)者(zhe)遇(yu)到(dao)的(de)最(zui)大(da)困(kun)難(nan)是(shi)如(ru)何(he)識(shi)別(bie)判(pan)斷(duan)幹(gan)擾(rao)峰(feng)屬(shu)於(yu)哪(na)一(yi)類(lei)。由(you)於(yu)找(zhao)不(bu)清(qing)問(wen)題(ti)根(gen)源(yuan)，所(suo)以(yi)也(ye)就(jiu)難(nan)以(yi)有(you)針(zhen)對(dui)性(xing)的(de)解(jie)決(jue)問(wen)題(ti)。異常的色譜峰指的是色譜圖中的無峰或出現負峰、寬峰、雙峰、肩峰、峰形不對稱等情況。異常峰是色譜實驗工作中最棘手的問題。這些峰嚴重影響色譜分析的結果。色譜圖中不可能有純正的高斯對稱峰 , 輕微的拖尾是正常的 , 這是由分離係統所決定的。在此僅對幾種異常峰進行分析。
1、峰前或峰後有小峰的分析
(1) 樣品不純。可改變不同的流動相和色譜柱 ,對樣品進行分離比較 , 選擇合適的分離條件。(2) 分析柱或保護柱柱頭塌陷。此情況較常見 ,可更換分析柱或保護柱後對峰形進行比較。柱頭塌陷時往往所有的峰都會出現峰分裂 。對色譜柱再生和清洗可以改善分離效果。(3) 色譜柱柱容量下降。當長時間使用後 , 有一些強保留組分吸附在柱子中 , 不大的進樣量往往就會出現峰分裂。用強洗脫能力的溶劑清洗色譜柱 , 或更換色譜柱可使問題得到改善。(4) 樣品溶劑與流動相不匹配或進樣體積過大。當樣品溶劑比流動相極性大時 , 有時即使進樣體積很小 , 也容易出現峰變形和裂分現象。建議用流動相溶解樣品。(5) 流動相不恰當。此情況較罕見 , 有些樣品在特定的色譜條件下可能存在結構的動態平衡 , 而出雙峰 , 這種雙峰是無法分離完全的 , 改變色譜條件尤其是p H 值會使峰形正常。(6) 樣品分解。不穩定的樣品在色譜分離過程中變成其他物質而出現雙峰。這時需改變樣品處理方法或色譜分離條件。
2、負峰分析
在色譜分析中有時會出現負峰或倒峰 , 大峰的左下就有一負峰。出現這種現象可能是由以下幾種原因引起的 , 可針對不同情況進行排除 , 進而使問題得到解決。(1) 流動相吸收本底值過高。此時可適當改變檢測波長。(2) 進樣過程中進入空氣。進行排氣處理 , 直到基線平穩再進樣。(3) 樣品組分的吸收低於流動相。可改變流動相或改變檢測波長。(4) 配製樣品的溶液與流動相不一樣。重新配製樣品 , 用與流動相一樣的溶劑配製或稀釋樣品。
3、前沿、拖尾峰分析
拖尾：1 幹擾峰，優化條件分離 ；2 色譜柱塌陷，更換色譜柱；3 流動相pH不合適，調節pH值 ；4 管路沒有接好，存在較大的死體積，可以重新接一下。前沿：1 溶劑選擇不合適，選擇合適的溶劑 ；2 樣品過載，降低進樣量；3 柱溫太低，升高柱溫 ；4 色譜柱損壞，更換色譜柱 ；圖(tu)譜(pu)前(qian)沿(yan)和(he)拖(tuo)尾(wei)的(de)原(yuan)因(yin)主(zhu)要(yao)是(shi)流(liu)動(dong)相(xiang)選(xuan)擇(ze)不(bu)合(he)適(shi)，可(ke)以(yi)相(xiang)應(ying)調(tiao)整(zheng)流(liu)動(dong)相(xiang)的(de)極(ji)性(xing)，或(huo)者(zhe)適(shi)當(dang)加(jia)入(ru)酸(suan)來(lai)調(tiao)整(zheng)，可(ke)以(yi)得(de)到(dao)較(jiao)好(hao)的(de)改(gai)善(shan)。一(yi)般(ban)來(lai)講(jiang)，酸(suan)堿(jian)在(zai)流(liu)動(dong)相(xiang)中(zhong)對(dui)於(yu)前(qian)沿(yan)和(he)拖(tuo)尾(wei)影(ying)響(xiang)較(jiao)大(da)。 柱前沿是可能因為柱超載，拖尾是可能因為樣品被汙染，選擇合適的流動相，調節好PH能夠改善這以情況。前輩們總是會告訴我們，拖尾峰與柱子有關，可能是過載，稀釋樣品再做，或換新柱做。 有時候托尾峰往往是有機性相近雜質沒有分開，此時，可以優化分析方法，或更換柱子試一試；也可能由於柱子使用時間太久柱效下降出現塌陷等原因；再有也會根樣品本身性質有關，基團需要流動相中添加能與之結合優化峰形的化學物質，要根據具體情況而定。
4、色譜雙峰產生的可能及判斷和處理
液相上有一句經典的話說得好 “出兩個峰肯定不是一種物質，出一個峰不一定是一種物質”。而色譜雙峰指的是明是一種物質，但在色譜圖中出現雙峰，而表明含二種物質。我將這種情況分為四種原因。 如果你分析樣品時發現每個色譜峰都雙峰出現（出峰越快，雙峰的可能性會減少），尤其采用單一純物質時，可以肯定色譜柱出問題－柱zhu頭tou受shou損sun或huo柱zhu頭tou固gu定ding相xiang變bian髒zang或huo流liu失shi。如ru果guo進jin樣yang量liang少shao，原yuan來lai色se譜pu柱zhu正zheng常chang，色se譜pu峰feng的de形xing狀zhuang多duo為wei一yi大da峰feng帶dai一yi小xiao峰feng，不bu一yi定ding拖tuo尾wei，這zhe一yi般ban應ying是shi柱zhu頭tou受shou堵du，將jiang色se譜pu柱zhu反fan過guo來lai接jie，用yong流liu動dong相xiang衝chong洗xi或huo酸suan洗xi或huo其qi它ta溶rong劑ji，將jiang堵du在zai柱zhu頭tou的de殘can留liu物wu衝chong掉diao，再zai反fan過guo來lai，一yi般ban情qing況kuang下xia就jiu行xing了le。當dang然ran不bu反fan衝chong，正zheng衝chong有you時shi也ye會hui正zheng常chang的de。如ru果guo峰feng拖tuo尾wei，雙shuang峰feng強qiang弱ruo相xiang差cha不bu大da，柱zhu頭tou固gu定ding相xiang變bian髒zang或huo流liu失shi可ke能neng性xing更geng大da，高gao頻pin紅hong外wai碳tan硫liu分fen析xi儀yi這zhe是shi可ke以yi將jiang進jin樣yang那na頭tou擰ning開kai，將jiang微wei孔kong濾lv片pian超chao聲sheng，柱zhu頭tou刮gua去qu一yi部bu分fen填tian料liao，重zhong新xin填tian上shang新xin填tian料liao擰ning緊jin，不bu過guo這zhe種zhong活huo，需xu要yao一yi定ding技ji術shu，同tong時shi不bu能neng老lao幹gan那na種zhong事shi，否fou則ze用yong不bu了le幾ji次ci，色se譜pu柱zhu就jiu會hui應ying柱zhu效xiao很hen低di而er報bao廢fei。 許多HPLC分析者對此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻都不會提到這方麵的內容，而這確是雙峰產生的一個很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、shui，jiagezhongtianjiajiyigaishanfenlixingneng。yangpinyibanyongyuliudongxiangxiangrongderongjirongjie。zuijiaderongjiefangfashiyongliudongxiangrongjie，danshihenduoqingkuangshibuyizhide。當用溶劑極性強度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體係中以水為主，樣品進樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質出雙峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一樣），且拖尾，保留時間會提前（相對進樣量少而言），jiangjinyangliangjianshaoyibanyishang，fengxingjiangbianweizhengchang。zheshiyangpinderongjiyuliudongxiangjixingxiangchataida，erliudongxianglaibujijiangqixishidadaopinghengzaochengde。shangmiantidaojinyangliangzaochengshuangfengdeyigeyuanyin，lingyigeyuanyinshi，jinyangliangbuyidingda，danjueduilianghenda，seputushangdeshuangfengjinkaozaiyiqi，jibenshangqigao，butuowei（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進樣就可以了，這是由於進樣量過大，色譜柱過載造成的。 有些樣品由於其化學結構的特點，存在互變異構現象，而這種互變異構體無(wu)法(fa)分(fen)開(kai)，而(er)是(shi)以(yi)一(yi)個(ge)動(dong)態(tai)平(ping)衡(heng)存(cun)在(zai)。在(zai)色(se)譜(pu)分(fen)析(xi)時(shi)，在(zai)一(yi)個(ge)特(te)定(ding)的(de)條(tiao)件(jian)下(xia)，一(yi)種(zhong)物(wu)質(zhi)將(jiang)出(chu)現(xian)雙(shuang)峰(feng)，雙(shuang)峰(feng)靠(kao)的(de)很(hen)近(jin)，基(ji)本(ben)齊(qi)高(gao)，不(bu)拖(tuo)尾(wei)，條(tiao)件(jian)稍(shao)一(yi)變(bian)化(hua)，尤(you)其(qi)pH，雙峰現象將消失，如紅黴素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC－MS下，用質譜檢測器，其質譜的總離子流圖上較明顯，例如我分析過的農藥啶蟲眯（吡蟲清）。 記錄的參數一般都內定的，不必修改，但GC和HPLC的參數是不完全一致的，例如C－R3A數據記錄儀上的一般記錄時間間隔GC為2ms，HPLC 為5ms，如果記錄間隔時間縮短，一個峰將變為二個峰或更多。
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