一、 原理

標記抗體法雖然具有許多優點，但也存在一些難以克服的問題，如標記抗體的分子增大，對細胞膜和組織的穿透力減弱；化學交聯反應對抗體和酶的活性有所影響；結(jie)合(he)物(wu)中(zhong)未(wei)標(biao)記(ji)的(de)抗(kang)體(ti)可(ke)與(yu)抗(kang)原(yuan)競(jing)爭(zheng)結(jie)合(he)，影(ying)響(xiang)檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)的(de)敏(min)感(gan)性(xing)等(deng)。不(bu)標(biao)記(ji)抗(kang)體(ti)法(fa)可(ke)以(yi)避(bi)免(mian)上(shang)述(shu)的(de)不(bu)利(li)影(ying)響(xiang)因(yin)素(su)，通(tong)過(guo)一(yi)係(xi)統(tong)的(de)非(fei)標(biao)記(ji)抗(kang)體(ti)的(de)免(mian)疫(yi)學(xue)反(fan)應(ying)
，對(dui)組(zu)織(zhi)中(zhong)的(de)抗(kang)原(yuan)進(jin)行(xing)定(ding)位(wei)檢(jian)測(ce)。不(bu)標(biao)記(ji)抗(kang)體(ti)法(fa)又(you)可(ke)分(fen)為(wei)用(yong)標(biao)記(ji)物(wu)顯(xian)示(shi)和(he)不(bu)同(tong)標(biao)記(ji)物(wu)顯(xian)示(shi)兩(liang)種(zhong)方(fang)法(fa)。前(qian)者(zhe)利(li)用(yong)基(ji)因(yin)工(gong)程(cheng)方(fang)法(fa)製(zhi)備(bei)雙(shuang)特(te)異(yi)性(xing)抗(kang)體(ti)的(de)F(ab′)2
，一個Fab片段與標本中的抗原結合，一個Fab是shi抗kang體ti蛋dan白bai的de結jie合he片pian段duan。在zai抗kang體ti與yu標biao本ben作zuo用yong後hou，再zai加jia入ru鐵tie蛋dan白bai與yu抗kang體ti結jie合he
，從cong而er顯xian示shi組zu織zhi內nei抗kang原yuan的de所suo在zai部bu位wei。後hou者zhe則ze用yong磷lin酸suan鎢wu負fu染ran後hou，直zhi接jie電dian鏡jing觀guan察cha。

二、材料及試劑

1．待檢病毒材料  如：糞便，氣管分泌物
、腦脊髓液、組織培養液等。

2．高速離心機

3．已知抗體

4．磷鎢酸

5．瓊脂糖

6．其它

三、操作方法

1．經典法

（1）將被檢病毒材料0.9ml，加1︰5～1︰10稀釋的特異性免疫血清0.1ml充分混合。

（2）置37℃作用1h或37℃1h後再置4℃過夜。

（3）以17 000r/min～23 000r/min離心90min。

（4）吸去上清，將離心管口倒置於濾紙上，吸去殘留液體。

（5）沉澱物中加少量H2O混懸，用3%磷鎢酸(pH6.0)負染20～30s
，滴加於400目銅網Fomnvar膜上
，用濾紙從銅網邊緣輕輕吸去多餘的負染液。

（6）在透射電鏡下4×104倍觀察。

2．快速法(瓊脂擴散法)

（1）同經典法(1)
、(2)步驟，製備免疫複合物。

（2）以生理鹽水或pH 7.2巴比妥緩衝液製備1%瓊脂糖，趁熱澆注於潔淨的載玻片上，每片3ml，待冷卻凝固後
，在凝膠麵上等距離放置直徑4mm玻璃珠數粒

，再於凝膠麵上澆注1%瓊脂糖2ml～3ml
，冷卻凝固後，取出玻璃珠，使凝膠形成凹孔。

（3）將普通濾紙剪成2×3cm大小

，3～4層重疊。用小刀將帶有凹孔的瓊脂糖切成小塊,每塊帶有一個凹孔,平放在濾紙上。

（4）在凹孔內
，加入製備好的含病毒的免疫複合物懸液。

（5）將電鏡載網的Fomnvar膜麵向下倒懸於液滴上。由於瓊脂糖的吸水作用，20min～30min後，可將液滴的水分吸幹，而濃縮的免疫複合物則粘附在載網膜上。

（6）在載網膜上滴加3%磷鎢酸負染20s，過量的負染液用濾紙在載網邊緣輕輕吸去。

（7）於透射電鏡4×104倍下觀察。

四、結果判定

直接觀察病毒粒子的形態。由於離心濃縮的處理和特異性抗體的加入，大大提高了觀察的敏感性。