顯微鏡是觀察細胞的主要工具。根據光源不同
，可分為光學顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。前者以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為光源，後者則以電子束為光源。

—
、光學顯微鏡

（一）
、普通光學顯微鏡

普通生物顯微鏡由3部分構成，即：①照明係統
，包括光源和聚光器；②光學放大係統，由物鏡和目鏡組成
，是顯微鏡的主體

，為了消除球差和色差
，目鏡和物鏡都由複雜的透鏡組構成；③機械裝置
，用於固定材料和觀察方便（圖2-1）。

顯微鏡物象是否清楚不僅決定於放大倍數，還與顯微鏡的分辨力（resolution）有關，分辨力是指顯微鏡（或人的眼睛距目標25cm處）能分辨物體最小間隔的能力
，分辨力的大小決定於光的波長和鏡口率以及介質的折射率
，用公式表示為：

式中：n=介質折射率；α=鏡口角（標本對物鏡鏡口的張角），N.A.=鏡口率（numeric aperture）。鏡口角總是要小於180?，所以sina/2的最大值必然小於1。

製作光學鏡頭所用的玻璃折射率為1.65～1.78，所用介質的折射率越接近玻璃的越好。對於幹燥物鏡來說
，介質為空氣
，鏡口率一般為0.05～0.95
；油鏡頭用香柏油為介質
，鏡口率可接近1.5。

普通光線的波長為400～700nm，因此顯微鏡分辨力數值不會小於0.2μm
，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般顯微鏡設計的最大放大倍數通常為1000X。

（二）、熒光顯微鏡

細胞中有些物質
，如葉綠素等，受紫外線照射後可發熒光；另有一些物質本身雖不能發熒光
，但如果用熒光染料或熒光抗體染色後，經紫外線照射亦可發熒光

，熒光顯微鏡（圖2-2，3
，4）就是對這類物質進行定性和定量研究的工具之一。

熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區別：

1、照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射於樣品上（圖2-3）；

2、光源為紫外光
，波長較短，分辨力高於普通顯微鏡；

3、有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光
，目鏡和物鏡之間的用於濾除紫外線
，用以保護人目。

（三）、激光共聚焦掃描顯微鏡


 

激光共聚焦掃描顯微鏡（laser confocal scanning microscope，圖2-5、6）用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐zhu麵mian快kuai速su掃sao描miao成cheng像xiang，掃sao描miao的de激ji光guang與yu熒ying光guang收shou集ji共gong用yong一yi個ge物wu鏡jing

，物wu鏡jing的de焦jiao點dian即ji掃sao描miao激ji光guang的de聚ju焦jiao點dian，也ye是shi瞬shun時shi成cheng像xiang的de物wu點dian。由you於yu激ji光guang束shu的de波bo長chang較jiao短duan，光guang束shu很hen細xi，所suo以yi共gong焦jiao激ji光guang掃sao描miao顯xian微wei鏡jing有you較jiao高gao的de分fen辨bian力li
，大da約yue是shi普pu通tong光guang學xue顯xian微wei鏡jing的de3bei。xitongjingyicitiaojiao，saomiaoxianzhizaiyangpindeyigepingmiannei。tiaojiaoshendubuyiyangshi，jiukeyihuodeyangpinbutongshenducengcidetuxiang，zhexietuxiangxinxidouchuyujisuanjinei
，tongguojisuanjifenxihemoni
，jiunengxianshixibaoyangpindelitijiegou。

激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用於觀察細胞形態
，也可以用於細胞內生化成分的定量分析、光密度統計以及細胞形態的測量。

（四）、暗視野顯微鏡

暗視野顯微鏡（dark field microscope，圖2-7）的(de)聚(ju)光(guang)鏡(jing)中(zhong)央(yang)有(you)當(dang)光(guang)片(pian)，使(shi)照(zhao)明(ming)光(guang)線(xian)不(bu)直(zhi)接(jie)進(jin)人(ren)物(wu)鏡(jing)，隻(zhi)允(yun)許(xu)被(bei)標(biao)本(ben)反(fan)射(she)和(he)衍(yan)射(she)的(de)光(guang)線(xian)進(jin)入(ru)物(wu)鏡(jing)，因(yin)而(er)視(shi)野(ye)的(de)背(bei)景(jing)是(shi)黑(hei)的(de)

，物(wu)體(ti)的(de)邊(bian)緣(yuan)是(shi)亮(liang)的(de)。利(li)用(yong)這(zhe)種(zhong)顯(xian)微(wei)鏡(jing)能(neng)見(jian)到(dao)小(xiao)至(zhi) 4~200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。

（五）
、相差顯微鏡

相差顯微鏡（phasecontrast microscope
，圖2-8、9）由P．Zernike於1932年發明，並因此獲1953年諾貝爾物理獎。這種顯微鏡最大的特點是可以觀察未經染色的標本和活細胞。

相(xiang)差(cha)顯(xian)微(wei)鏡(jing)的(de)基(ji)本(ben)原(yuan)理(li)是(shi)，把(ba)透(tou)過(guo)標(biao)本(ben)的(de)可(ke)見(jian)光(guang)的(de)光(guang)程(cheng)差(cha)變(bian)成(cheng)振(zhen)幅(fu)差(cha)，從(cong)而(er)提(ti)高(gao)了(le)各(ge)種(zhong)結(jie)構(gou)間(jian)的(de)對(dui)比(bi)度(du)，使(shi)各(ge)種(zhong)結(jie)構(gou)變(bian)得(de)清(qing)晰(xi)可(ke)見(jian)。光(guang)線(xian)透(tou)過(guo)標(biao)本(ben)後(hou)發(fa)生(sheng)折(zhe)射(she)，偏(pian)離(li)了(le)原(yuan)來(lai)的(de)光(guang)路(lu)，同(tong)時(shi)被(bei)延(yan)遲(chi)了(le)1/4λ（波長）
，如果再增加或減少1/4λ

，則光程差變為1/2λ
，兩束光合軸後幹涉加強，振幅增大或減下

，提高反差。在構造上，相差顯微鏡有不同於普通光學顯微鏡兩個特殊之處：

1
、環形光闌（annular diaphragm）位於光源與聚光器之間
，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐
，焦聚到標本上。

2、相位板（annular phaseplate）在物鏡中加了塗有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

①A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸後光波相加，振幅加大
，標本結構比周圍介質更加變亮，形成亮反差（或稱負反差）。

② B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸後光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結構比周圍介質更加變暗。


 

（六）、偏光顯微鏡

偏光顯微鏡（polarizing microscope）用於檢測具有雙折射性的物質，如纖維絲、紡錘體
、膠原、染色體等等。和普通顯微鏡不同的是：其光源前有偏振片（起偏器），使進入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器（一個偏振方向與起偏器垂直的的起偏器），zhezhongxianweijingdezaiwutaishikeyixuanzhuande，dangzaiwutaishangfangrudanzheshedewuzhishi，wulunruhexuanzhuanzaiwutai
，youyulianggepianzhenpianshichuizhide
，xianweijinglikanbudaoguangxian，erfangrushuangzheshexingwuzhishi
，youyuguangxiantongguozheleiwuzhishifashengpianzhuan，yincixuanzhuanzaiwutaibiannengjiancedaozhezhongwuti。

（七）

、微分幹涉差顯微鏡

1952年
，Nomarski在相差顯微鏡原理的基礎上發明了微分幹涉差顯微鏡（differential interference contrast microscope）。DIC顯微鏡又稱Nomarski相差顯微鏡（Nomarki contrast microscope），其優點是能顯示結構的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標本可略厚一點
，折射率差別更大，故影像的立體感更強。

DIC顯微鏡的物理原理完全不同於相差顯微鏡，技術設計要複雜得多。DIC利用的是偏振光
，有四個特殊的光學組件：偏振器（polarizer）、DIC棱鏡、DIC滑行器和檢偏器（analyzer）。偏振器直接裝在聚光係統的前麵


，使光線發生線性偏振。在聚光器中則安裝了石英Wollaston棱鏡，即DIC棱鏡，此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光（x和y），erzhechengyixiaojiajiao。juguangqijiangliangshuguangtiaozhengchengyuxianweijingguangzhoupingxingdefangxiang。zuichuliangshuguangxiangweiyizhi，zaichuanguobiaobenxianglindequyuhou，youyubiaobendehouduhezheshelvbutong，yinqileliangshuguangfashengleguangchengcha。zaiwujingdehoujiaomianchuanzhuanglediergeWollaston棱鏡
，即DIC滑行器，它把兩束光波合並成一束。這時兩束光的偏振麵（x和y）仍然存在。最後光束穿過第二個偏振裝置
，即檢偏器。在光束形成目鏡DIC影像之前，檢偏器與偏光器的方向成直角。檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振麵的兩束光，從而使二者發生幹涉。x和y波的光程差決定著透光的多少。光程差值為0時，沒有光穿過檢偏器；光guang程cheng差cha值zhi等deng於yu波bo長chang一yi半ban時shi，穿chuan過guo的de光guang達da到dao最zui大da值zhi。於yu是shi在zai灰hui色se的de背bei景jing上shang，標biao本ben結jie構gou呈cheng現xian出chu亮liang暗an差cha。為wei了le使shi影ying像xiang的de反fan差cha達da到dao最zui佳jia狀zhuang態tai，可ke通tong過guo調tiao節jieDIC滑行器的縱行微調來改變光程差
，光程差可改變影像的亮度。調節DIChuaxingqikeshibiaobendexiweijiegouchengxianchuzhenghuofudetouyingxingxiang，tongchangshiyiceliang
，erlingyicean，zhebianzaochenglebiaobenderenweisanweilitigan，leisidalishishangdefudiao（圖2-10）。

DIC顯微鏡使細胞的結構
，特別是一些較大的細胞器，如核、線粒體等，立體感特別強，適合於顯微操作。目前像基因注入、核移植、轉基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進行。

（八）、倒置顯微鏡

組成和普通顯微鏡一樣，隻不過物鏡與照明係統顛倒，前者在載物台之下
，後者在載物台之上（圖2-11），用於觀察培養的活細胞
，具有相差物鏡。

進入20世紀80niandaiyilai，guangxuexianweijingdeshejihezhizuoyouyoulehendadefazhan
，qifazhanqushizhuyaobiaoxianzai，zhuzhongshiyongxingheduogongnengfangmiandegaijin。zaizhuangpeishejishangquyucaiyongzuhefangshi，jiputongguangjingjiaxiangcha、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置於一體，從而操作靈活，使用方便。

二、電子顯微鏡

（一）

、透射電子顯微鏡

1、基本原理

在光學顯微鏡下無法看清小於0.2?m的細微結構，這些結構稱為亞顯微結構（submicroscopic structures）或超微結構（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要想看清這些結構，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。1932年Ruska發明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）
，電子束的波長要比可見光和紫外光短得多

，並且電子束的波長與發射電子束的電壓平方根成反比
，也就是說電壓越高波長越短。目前TEM的分辨力可達0.2nm。

電子顯微鏡（圖2-12）與(yu)光(guang)學(xue)顯(xian)微(wei)鏡(jing)的(de)成(cheng)像(xiang)原(yuan)理(li)基(ji)本(ben)一(yi)樣(yang)
，所(suo)不(bu)同(tong)的(de)是(shi)前(qian)者(zhe)用(yong)電(dian)子(zi)束(shu)作(zuo)光(guang)源(yuan)，用(yong)電(dian)磁(ci)場(chang)作(zuo)透(tou)鏡(jing)。另(ling)外(wai)，由(you)於(yu)電(dian)子(zi)束(shu)的(de)穿(chuan)透(tou)力(li)很(hen)弱(ruo)，因(yin)此(ci)用(yong)於(yu)電(dian)鏡(jing)的(de)標(biao)本(ben)須(xu)製(zhi)成(cheng)厚(hou)度(du)約(yue)50nm左右的超薄切片。這種切片需要用超薄切片機（ultramicrotome）製作。電子顯微鏡的放大倍數最高可達近百萬倍
、由電子照明係統、電磁透鏡成像係統
、真空係統
、記錄係統
、電源係統等5部分構成。


 

2
、製樣技術

1）超薄切片

通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式推進樣品切片（圖2-13）
，切片厚度20~50nm

，切片采用重金屬鹽染色，以增大反差（圖2-14）。




 

2）負染技術

負染就是用重金屬鹽（如磷鎢酸
、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網上的樣品進行染色；吸去染料
，樣品幹燥後，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽
，而凸的出地方則沒有染料沉積，從而出現負染效果（圖2-15），分辨力可達1.5nm左右。

3）冰凍蝕刻

冰凍蝕刻（freeze-etching）亦稱冰凍斷裂（freeze-fracture）。標本置於-100?C的幹冰或-196?C的液氮中，進行冰凍。然後用冷刀驟然將標本斷開，升溫後，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷麵結構，稱為蝕刻（etching）。蝕刻後，向斷麵以45度角噴塗一層蒸汽鉑
，再以90度角噴塗一層碳，加強反差和強度。然後用次氯酸鈉溶液消化樣品，把碳和鉑的膜剝下來
，此膜即為複膜（replica）。複膜顯示出了標本蝕刻麵的形態
，在電鏡下得到的影像即代表標本中細胞斷裂麵處的結構（圖2-16）。

（二）、掃描電子顯微鏡

掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM，圖2-17、18、19）於20世紀60年(nian)代(dai)問(wen)世(shi)
，用(yong)來(lai)觀(guan)察(cha)標(biao)本(ben)的(de)表(biao)麵(mian)結(jie)構(gou)。其(qi)工(gong)作(zuo)原(yuan)理(li)是(shi)用(yong)一(yi)束(shu)極(ji)細(xi)的(de)電(dian)子(zi)束(shu)掃(sao)描(miao)樣(yang)品(pin)，在(zai)樣(yang)品(pin)表(biao)麵(mian)激(ji)發(fa)出(chu)次(ci)級(ji)電(dian)子(zi)，次(ci)級(ji)電(dian)子(zi)的(de)多(duo)少(shao)與(yu)電(dian)子(zi)束(shu)入(ru)射(she)角(jiao)有(you)關(guan)，也(ye)就(jiu)是(shi)說(shuo)與(yu)樣(yang)品(pin)的(de)表(biao)麵(mian)結(jie)構(gou)有(you)關(guan)，次(ci)級(ji)電(dian)子(zi)由(you)探(tan)測(ce)體(ti)收(shou)集(ji)，並(bing)在(zai)那(na)裏(li)被(bei)閃(shan)爍(shuo)器(qi)轉(zhuan)變(bian)為(wei)光(guang)信(xin)號(hao)

，再(zai)經(jing)光(guang)電(dian)倍(bei)增(zeng)管(guan)和(he)放(fang)大(da)器(qi)轉(zhuan)變(bian)為(wei)電(dian)信(xin)號(hao)來(lai)控(kong)製(zhi)熒(ying)光(guang)屏(ping)上(shang)電(dian)子(zi)束(shu)的(de)強(qiang)度(du)，顯(xian)示(shi)出(chu)與(yu)電(dian)子(zi)束(shu)同(tong)步(bu)的(de)掃(sao)描(miao)圖(tu)像(xiang)。圖(tu)像(xiang)為(wei)立(li)體(ti)形(xing)象(xiang)，反(fan)映(ying)了(le)標(biao)本(ben)的(de)表(biao)麵(mian)結(jie)構(gou)。為(wei)了(le)使(shi)標(biao)本(ben)表(biao)麵(mian)發(fa)射(she)出(chu)次(ci)級(ji)電(dian)子(zi)，標(biao)本(ben)在(zai)固(gu)定(ding)、脫水後
，要噴塗上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發出次級電子信號。

目前掃描電鏡的分辨力為6～10nm，人眼能夠區別熒光屏上兩個相距0.2mm的光點，則掃描電鏡的最大有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。

（三）、掃描隧道顯微鏡

掃描隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope，STM）由Binnig等1981年nian發fa明ming
，根gen據ju量liang子zi力li學xue原yuan理li中zhong的de隧sui道dao效xiao應ying而er設she計ji。當dang原yuan子zi尺chi度du的de針zhen尖jian在zai不bu到dao一yi個ge納na米mi的de高gao度du上shang掃sao描miao樣yang品pin時shi，此ci處chu電dian子zi雲yun重zhong疊die，外wai加jia一yi電dian壓ya（2mV～2V）
，針(zhen)尖(jian)與(yu)樣(yang)品(pin)之(zhi)間(jian)產(chan)生(sheng)隧(sui)道(dao)效(xiao)應(ying)而(er)有(you)電(dian)子(zi)逸(yi)出(chu)，形(xing)成(cheng)隧(sui)道(dao)電(dian)流(liu)。電(dian)流(liu)強(qiang)度(du)和(he)針(zhen)尖(jian)與(yu)樣(yang)品(pin)間(jian)的(de)距(ju)離(li)有(you)函(han)數(shu)關(guan)係(xi)，當(dang)探(tan)針(zhen)沿(yan)物(wu)質(zhi)表(biao)麵(mian)按(an)給(gei)定(ding)高(gao)度(du)掃(sao)描(miao)時(shi)
，因(yin)樣(yang)品(pin)表(biao)麵(mian)原(yuan)子(zi)凹(ao)凸(tu)不(bu)平(ping)
，使(shi)探(tan)針(zhen)與(yu)物(wu)質(zhi)表(biao)麵(mian)間(jian)的(de)距(ju)離(li)不(bu)斷(duan)發(fa)生(sheng)改(gai)變(bian)，從(cong)而(er)引(yin)起(qi)電(dian)流(liu)不(bu)斷(duan)發(fa)生(sheng)改(gai)變(bian)。將(jiang)電(dian)流(liu)的(de)這(zhe)種(zhong)改(gai)變(bian)圖(tu)像(xiang)化(hua)即(ji)可(ke)顯(xian)示(shi)出(chu)原(yuan)子(zi)水(shui)平(ping)的(de)凹(ao)凸(tu)形(xing)態(tai)。掃(sao)描(miao)隧(sui)道(dao)顯(xian)微(wei)鏡(jing)的(de)分(fen)辨(bian)率(lv)很(hen)高(gao)，橫(heng)向(xiang)為(wei)0.1～0.2nm，縱向可達0.001nm。它的優點是三態（固態、液態和氣態）物質均可進行觀察，而普通電鏡隻能觀察製作好的固體標本。

利用掃描隧道顯微鏡直接觀察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白質等分子的原子布陣
，和某些生物結構，如生物膜、細胞壁等的原子排列。

三、顯微操作技術

顯微操作技術（micromanipulation technique）是指在高倍複式顯微鏡下，利用顯微操作器（micromanipulator，圖2-20）進行細胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控製顯微注射針在顯微鏡視野內移動的機械裝置。

顯微操作技術包括細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術、胚胎移植以及顯微切割等。細胞核移植技術已有幾十年的曆史，Gordon等人（1962）對非洲爪蟾進行核移植獲得成功。我國著名學者童第周等在魚類細胞核移植方麵進行了許多工作，並取得了豐碩成果