實驗原理:細胞中的DNA受1NHC1,60℃水解作用以後,核酸中的嘌呤堿很快完全被除掉,使脫氧核糖中潛在的醛基獲得自由狀態。水解後,組織要經水洗再移至希夫(Schiff)試劑 中,希夫試劑 即同露出來的醛基發生反應,呈現紫紅色。這個反應是Feulgen在1942年提出來的,是DNA的一個特異性檢查法。
水(shui)解(jie)的(de)時(shi)間(jian)很(hen)重(zhong)要(yao),因(yin)為(wei)核(he)酸(suan)的(de)水(shui)解(jie)有(you)兩(liang)個(ge)過(guo)程(cheng),第(di)一(yi),漂(piao)呤(ling)堿(jian)很(hen)快(kuai)被(bei)除(chu)掉(diao),脫(tuo)氧(yang)核(he)糖(tang)中(zhong)潛(qian)在(zai)的(de)醛(quan)基(ji)顯(xian)露(lu)出(chu)來(lai),第(di)二(er),組(zu)蛋(dan)白(bai)和(he)核(he)酸(suan)愈(yu)來(lai)愈(yu)多(duo)地(di)被(bei)除(chu)掉(diao)。在(zai)短(duan)時(shi)間(jian)的(de)水(shui)解(jie)作(zuo)用(yong)以(yi)後(hou),第(di)一(yi)個(ge)過(guo)程(cheng)占(zhan)優(you)勢(shi),這(zhe)時(shi)候(hou)用(yong)希(xi)夫(fu)試(shi)劑(ji)染(ran)色(se),染(ran)色(se)體(ti)的(de)染(ran)色(se)作(zuo)用(yong)最(zui)強(qiang)。隨(sui)著(zhe)水(shui)解(jie)作(zuo)用(yong)的(de)繼(ji)續(xu)進(jin)行(xing),第(di)二(er)個(ge)過(guo)程(cheng)逐(zhu)漸(jian)變(bian)成(cheng)優(you)勢(shi),因(yin)此(ci)水(shui)解(jie)液(ye)中(zhong)的(de)希(xi)夫(fu)反(fan)應(ying)增(zeng)強(qiang),而(er)染(ran)色(se)體(ti)中(zhong)的(de)希(xi)夫(fu)應(ying)減(jian)弱(ruo)。最(zui)後(hou),第(di)二(er)個(ge)過(guo)程(cheng)超(chao)過(guo)第(di)一(yi)過(guo)程(cheng)時(shi),染(ran)色(se)體(ti)也(ye)隨(sui)之(zhi)停(ting)止(zhi)反(fan)應(ying)。
希夫試劑是堿性品紅———亞硫酸溶液,呈無色。與DNA醛基反應後,使堿性品紅恢複原來的紅色。
二、實驗目的:觀察蠶豆根尖細胞或其它根尖細胞內染色體中的DNA,以及染色體在有絲分裂中的行為,掌握Feulgen染色方法。
三、實驗材料:上次實驗製成了石蠟切片。
四、實驗準備:
1.用具 立式染色缸一套,鑷子,蓋玻片,小漏鬥,鐵架,毛邊紙,玻璃棒,顯微鏡,恒溫水浴 鍋,溫度計,燒杯,棕色瓶,黑紙。
2.玻璃器皿的清洗 zhuyaoshiransegangdeqingxi,yibanyongfeizaofenxi,yongshuichongjingjike,rubunengxijingshi,yaoyongxiyejinpaohou,zaichongxi,zilaishuixihou,zaiyongshaoliangzhengliushuiguoxiyici。shengfang100%酒精、二甲苯的染色缸必須幹燥,缸蓋內緣必須塗以幾士林,以防止蒸發和收水分,影響濃度。染色缸上要貼上標簽。
3.實驗所需藥口及配製
濃鹽酸(36—38%),堿性品紅,偏重亞硫酸鈉(Na2 S2 O5 );
亞硫酸鈉(Na2 SO3 ),固綠(fast green),加拿大中性樹膠乙醇(30—100%),二甲苯。
藥品配製:
1各種濃度的乙醇配製.
21NHCI配製:取濃HCI 82.5毫升加蒸餾水至1000毫升,搖勻。
3Sciff 試劑的配製
0.5克堿性品紅,加到已經煮沸的100毫升蒸餾水中,再煮沸3—4分鍾,待溶液冷卻到50℃時過濾,再等溶液冷到25℃以下時,加入10毫升的1NHCI和1。5克偏重亞硫酸鈉,裝在棕色瓶中,塞緊瓶子,用黑紙包好,放在暗處,第二天觀察,溶液還是淡紅色就不能用,隻得重配。
偏重亞硫酸鈉與1NHCI反應,放出SO2 ,SO2 與堿性品紅反應,生成堿性品紅--亞硫酸溶液,呈無色。
4漂染液的配製
先配10%的亞硫酸鈉溶液。
把10%亞硫酸鈉溶液10毫升加200毫升蒸餾水,再加10毫升1NHCI,即成漂當液。
5固綠染色液
0.5克固綠溶於100毫升95%乙醇溶液。
五、實驗步驟:
2.水解 先在恒溫水浴 箱中準備好恒溫60℃的1NHCI。注(zhu)意(yi)一(yi)定(ding)要(yao)控(kong)製(zhi)好(hao)溫(wen)度(du)不(bu)能(neng)過(guo)高(gao),高(gao)了(le)醛(quan)基(ji)要(yao)破(po)壞(huai),低(di)了(le)小(xiao)解(jie)不(bu)充(chong)分(fen),醛(quan)基(ji)不(bu)能(neng)釋(shi)放(fang)出(chu)來(lai)。水(shui)解(jie)的(de)時(shi)間(jian)長(chang)短(duan)要(yao)根(gen)據(ju)材(cai)料(liao),以(yi)及(ji)固(gu)定(ding)液(ye)的(de)種(zhong)類(lei)而(er)定(ding)。根(gen)據(ju)試(shi)驗(yan)結(jie)果(guo),取(qu)一(yi)個(ge)適(shi)當(dang)時(shi)間(jian)。
因加拿大樹膠溶於二甲苯,所以片子一定要經二甲苯透明後才進行封片,操作方法如下:
1.用鑷子從二甲苯中取出載玻片,以毛邊紙吸幹餘液。
2.左(zuo)手(shou)開(kai)啟(qi)樹(shu)膠(jiao)瓶(ping),右(you)手(shou)用(yong)瓶(ping)中(zhong)玻(bo)璃(li)棒(bang)蘸(zhan)取(qu)樹(shu)膠(jiao)滴(di)於(yu)載(zai)玻(bo)片(pian)上(shang),並(bing)隨(sui)即(ji)蓋(gai)好(hao)瓶(ping)蓋(gai)。樹(shu)膠(jiao)的(de)用(yong)量(liang)視(shi)蓋(gai)玻(bo)片(pian)大(da)小(xiao)而(er)定(ding)。要(yao)使(shi)樹(shu)膠(jiao)在(zai)蓋(gai)玻(bo)片(pian)下(xia)滿(man)布(bu),不(bu)發(fa)生(sheng)過(guo)多(duo)或(huo)不(bu)足(zu)。
3niequjiejinggaibopian,yiyibianjiaoyuzaibopianshang,ranhouxuxufangxia,shishujiaobumangaibopianyuzaibopianzhijian。chanshengqipaodeyuanyinshifugaitaikuaishujiaoyongliangbuzu,huoshujiaoguochou。qipaoqinruhou,fangaijingjian,qieshibiaobentuise。ruyouqipaochansheng,zekeyizaikaojinqipaodeyibianzaidishujiaoyidi,ranhouqingyagaibopian,shiqipaoyichu。
片子封片後,放在切片木框上,讓其自然幹燥,即可保存。
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