三、堿變性法: 取血清20ul,加入1mol/L NaOH 20ul,37℃30min,離心,加 1mol/L HCl 20ul,離心後,取上清5ul,用於PCR擴增。*亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L,37℃1h,再加HCL中和離心後取上清10ul做PCR,其特異性和敏感性較前法 更好。
四、煮沸法: 經離心洗滌過的組織細胞,分泌物及血液標本,加適量無菌蒸餾水或PBS,混勻 後,100℃煮沸10~15min,14000r/min 10min,取上清做PCR.
五、碘化鈉法: 取組織細胞及抗凝血液10~100ul,加等體積的6MNaI,反複輕混 20s,加等體積:(49:1)振勻後,離心取上清加0.6體積的異丙醇,混勻後 置室溫3min.14000r/min 10min,沉澱加10~100ul,TE溶解,取5~10ul做PCR,亦有 用100ul血清加裂解液300ul(6M NaI,0.5%十二烷基肌酸鈉,10ug糖原,26mmol/L pH8.0 Tris-HCL,13mmol/LEDTA)混勻後,60℃15min,加等體積異丙醇,離心沉定 後,加TE液用於PCR擴增,其產量和質量較高。
六、異硫氰酸胍法
此法主要用於RNA的提取。標本為組織細胞及血清等。
1、異硫氰酸胍消化液
異硫氰酸胍4mol/L
檸檬酸鈉(PH7.0)25mmol/L
十二烷基肌酸鈉0.5%
β-巰基乙醇0.1mol/L
2、消化方法: 用50~100ul細胞懸液及血清,加等體積的異硫氰酸胍消化液振混勻 後,或65℃1小時,或室溫放置數分鍾,然後加1/10體積的3mmol/L pH5.2的醋酸鈉緩 衝液,再加等體積的酚:,用力振搖約10s,10000r/min,離心5min,取上清加等 體積異丙醇-20℃放置3h後,14000r/min離心15min,沉定用75%冰冷乙醇離心洗滌1~ 2次,真空幹燥,沉澱用TE緩衝液溶解即可用於逆轉錄PCR擴增,或放-20℃保存。
其它消化處理標本提模板核酸的方法有①異硫氰酸胍一二氧化矽法②異硫氰酸胍-玻璃粉法。③Chelex-100法。④全血直接擴增法⑤尿素消化裂解法。各有千秋,可根據情況選用。
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