熒光顯微鏡原理熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學的基本工具。它是由光源、濾板係統和光學係統等主要部件組成。是利用一定波長的光激發標本發射熒光，通過物鏡和目鏡係統放大以觀察標本的熒光圖像

(一)光源

現在多采用200W的de超chao高gao壓ya汞gong燈deng作zuo光guang源yuan，它ta是shi用yong石shi英ying玻bo璃li製zhi作zuo
，中zhong間jian呈cheng球qiu形xing，內nei充chong一yi定ding數shu量liang的de汞gong，工gong作zuo時shi由you兩liang個ge電dian極ji間jian放fang電dian
，引yin起qi水shui銀yin蒸zheng發fa
，球qiu內nei氣qi壓ya迅xun速su升sheng高gao，當dang水shui銀yin完wan全quan蒸zheng發fa時shi，可ke達da50～70個標準大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。chaogaoyagongdengdefaguangshidianjijianfangdianshishuiyinfenzibuduanjielihehaiyuanguochengzhongfasheguangliangzidejieguo。tafashehenqiangdeziwaihelanziguang，zuyijifageleiyingguangwuzhi，yinci，weiyingguangxianweijingpubiancaiyong。

超高壓汞燈也散發大量熱能。因此
，燈室必須有良好的散熱條件，工作環境溫度不宜太高。

新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時間後，則需要高壓啟動(約為15000V)，啟動後，維持工作電壓一般為50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開動一次工作時間愈短，則壽命愈短
，如開一次隻工作20min，則壽命降低50%。yinci，shiyongshijinliangjianshaoqidongcishu。dengpaozaishiyongguochengzhong，qiguangxiaoshizhujianjiangdide。dengximiehouyaodengdailengquecainengzhongxinqidong。dianrandengpaohoubukelijiguanbi，yimianshuiyinzhengfabuwanquanersunhuaidianji，yibanxuyaodeng15min。由於超高壓汞燈壓力很高

，紫外線強烈
，因此燈泡必須置燈室中方可點燃，以免傷害眼睛和發生爆炸時造成操作。

超高壓汞燈(100W或200W)光源的電路和包括變壓、鎮流、啟動幾個部分。在燈室上有調節燈泡發光中心的係統
，燈泡球部後麵安裝有鍍鋁的凹麵反射鏡，前麵安裝有集光透鏡。

國產超高壓汞燈GCQ-200型性能良好
，可以代替HBO-200等型的進口燈泡
，平均壽命在200h以上
，價格也比較低。

我國研製的一種簡易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置，體積小，重量輕，功率小，交、直流兩用(自帶直流電源)，易於攜帶，使用方便
，已推廣應用。

(二)濾色係統

濾lv色se係xi統tong是shi熒ying光guang顯xian微wei鏡jing的de重zhong要yao部bu位wei，由you激ji發fa濾lv板ban和he壓ya製zhi濾lv板ban組zu成cheng。濾lv板ban型xing號hao，各ge廠chang家jia名ming稱cheng常chang不bu統tong一yi。濾lv板ban一yi般ban都dou以yi基ji本ben色se調tiao命ming名ming，前qian麵mian字zi母mu代dai表biao色se調tiao，後hou麵mian字zi母mu代dai表biao玻bo璃li，數shu字zi代dai表biao型xing號hao特te點dian。如ru德de國guo產chan品pin(Schott)BG12，就是種藍色玻璃

，B是藍色的第一個字母，G是玻璃的第一個字母；我國產品的名稱已統一用拚音字母表示
，如相當於BG12的藍色濾板名為QB24
，Q是青色(藍色)拚音的第一個字母，B是玻璃拚音的第一個字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名，如K530
，就是表示壓製濾長530nm以下的光而透過530nm以上的光。還有的廠家的濾板完全以數字命名
，如美國Corning廠的NO：5-58
，即相當於BG12。

1．激發濾板根據光源和熒光色素的特點
，可選用以下三類激發濾板，提供一定波長範圍的激發光。

紫外光激發濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過
，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38

，以除去紅色尾波。

紫外藍光激發濾板：此濾板可使300～450nm範圍內的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3
，外加BG-38。

紫藍光激發濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號為QB24(BG12)。

最大吸收峰在500nm以上者的熒光素(如羅達明色素)可用藍綠濾板(如B-7)激發。

近年開始采用金屬膜幹涉濾板
，由於針對性強，波長適當，因而激發效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITC專用KP490濾板和羅達明的S546綠色濾板

，均遠比玻璃濾板效果好。

激發濾板分薄厚兩種
，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些。基本要求是以獲得最明亮的熒光和最好的背景為準。

2．壓製濾板壓製濾板的作用是完全阻擋激發光通過
，提供相應濾長範圍的熒光。與激發濾板相對應，常用以下3種壓製濾板：

紫外光壓製濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。

紫藍光壓製濾板：能通過510nm以上濾長的熒光(綠到紅)
，能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。

紫外紫光壓製濾板：能通過460nm以上波長的熒光(藍到紅)，可與BG-3組合，常用OG-11K470AK490，K510。

(三)反光鏡

反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因為鋁對紫外光和可見光的藍紫區吸收少，反射達90%以上，而銀的反射隻有70%

；一般使用平麵反光鏡。

(四)聚光鏡

zhuanweiyingguangxianweijingshejizhizuodejuguangqishiyongshiyingbolihuoqitatouziwaiguangdebolizhicheng。fenmingshiyejuguangqideanshiyejuguangqiliangzhong。haiyouxiangchayingguangjuguangqi。

1．明視野聚光器在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強，使用方便，特別適於低

、中倍放大的標本觀察。

2．暗an視shi野ye聚ju光guang器qi暗an視shi野ye聚ju光guang器qi在zai熒ying光guang顯xian微wei鏡jing中zhong的de應ying用yong日ri益yi廣guang泛fan。因yin為wei激ji發fa光guang不bu直zhi接jie進jin入ru物wu鏡jing，因yin而er除chu散san射she光guang外wai
，激ji發fa光guang也ye不bu進jin入ru目mu鏡jing，可ke以yi使shi用yong薄bo的de激ji發fa濾lv板ban，增zeng強qiang激ji發fa光guang的de強qiang度du，壓ya製zhi濾lv板ban也ye可ke以yi很hen薄bo

，因yin紫zi外wai光guang激ji發fa時shi，可ke用yong無wu色se濾lv板ban(不透過紫外)而er仍reng然ran產chan生sheng黑hei暗an的de背bei景jing。從cong而er增zeng強qiang了le熒ying光guang圖tu像xiang的de亮liang度du和he反fan襯chen度du

，提ti高gao了le圖tu像xiang的de質zhi量liang，觀guan察cha舒shu適shi，可ke能neng發fa現xian亮liang視shi野ye難nan以yi分fen辨bian的de細xi微wei熒ying光guang顆ke粒li。

3．相xiang差cha熒ying光guang聚ju光guang器qi相xiang差cha聚ju光guang器qi與yu相xiang差cha物wu鏡jing配pei合he使shi用yong，可ke同tong時shi進jin行xing相xiang差cha和he熒ying光guang聯lian合he觀guan察cha，既ji能neng看kan到dao熒ying光guang圖tu像xiang，又you能neng看kan到dao相xiang差cha圖tu像xiang，有you助zhu於yu熒ying光guang的de定ding位wei準zhun確que。一yi般ban熒ying光guang觀guan察cha很hen少shao需xu要yao這zhe種zhong聚ju光guang器qi。

(五)物鏡

各種物鏡均可應用
，但最好用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能(波長範圍)適shi合he於yu熒ying光guang。由you於yu圖tu像xiang在zai顯xian微wei鏡jing視shi野ye中zhong的de熒ying光guang亮liang度du與yu物wu鏡jing鏡jing口kou率lv的de平ping方fang成cheng正zheng比bi，而er與yu其qi放fang大da倍bei數shu成cheng反fan比bi
，所suo以yi為wei了le提ti高gao熒ying光guang圖tu像xiang的de亮liang度du，應ying使shi用yong鏡jing口kou率lv大da的de物wu鏡jing。尤you其qi在zai高gao倍bei放fang大da時shi其qi影ying響xiang非fei常chang明ming顯xian。因yin此ci對dui熒ying光guang不bu夠gou強qiang的de標biao本ben
，應ying使shi用yong鏡jing口kou率lv大da的de物wu鏡jing
，配pei合he以yi盡jin可ke能neng低di的de目mu鏡jing(4×,5×，6.3×等)。

(六)目鏡

在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過去多用單筒目鏡，因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上，但目前研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便。

(七)落射光裝置

新型的落射光裝置是從光源來的光射到幹涉分光濾鏡後，波長短的部分(紫外和紫藍)由於濾鏡上鍍膜的性質而反射，當濾鏡對向光源呈45。傾斜時，則垂直射向物鏡
，經物鏡射向標本，使標本受到激發
，這時物鏡直接起聚光器的作用。同時，濾長長的部分(綠
、黃、紅等)，對(dui)濾(lv)鏡(jing)是(shi)可(ke)透(tou)的(de)
，因(yin)此(ci)
，不(bu)向(xiang)物(wu)鏡(jing)方(fang)向(xiang)反(fan)射(she)，濾(lv)鏡(jing)起(qi)了(le)激(ji)發(fa)濾(lv)板(ban)作(zuo)用(yong)，由(you)於(yu)標(biao)本(ben)的(de)熒(ying)光(guang)處(chu)在(zai)可(ke)見(jian)光(guang)長(chang)波(bo)區(qu)
，可(ke)透(tou)過(guo)濾(lv)鏡(jing)而(er)到(dao)達(da)目(mu)鏡(jing)觀(guan)察(cha)，熒(ying)光(guang)圖(tu)像(xiang)的(de)亮(liang)度(du)隨(sui)著(zhe)放(fang)大(da)倍(bei)數(shu)增(zeng)大(da)而(er)提(ti)高(gao)，在(zai)高(gao)放(fang)大(da)時(shi)比(bi)透(tou)射(she)光(guang)源(yuan)強(qiang)。它(ta)除(chu)具(ju)有(you)透(tou)射(she)式(shi)光(guang)源(yuan)的(de)功(gong)能(neng)外(wai)，更(geng)適(shi)用(yong)於(yu)不(bu)透(tou)明(ming)及(ji)半(ban)透(tou)明(ming)標(biao)本(ben)，如(ru)厚(hou)片(pian)、濾膜、菌落、組織培養標本等的直接觀察。近年研製的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置，稱之為落射熒光顯微鏡。
 

(一)載玻片

載玻片厚度應在0.8～1.2mmzhijian，taihoudepopian，yifangmianguangxishouduo，lingyifangmianbunengshijifaguangzaibiaobenshangjuji。zaibopianbixuguangjie
，houdujunyun，wumingxianzifayingguang。youshixuyongshiyingbolizaibopian。

(二)蓋玻片

蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發光，也可用幹涉蓋玻片，這是一種特製的表麵鍍有若幹層對不同波長的光起不同幹涉作用的物質(如氟化鎂)的蓋玻片
，它可以使熒光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光女可激發標本。

(三)標本

組(zu)織(zhi)切(qie)片(pian)或(huo)其(qi)他(ta)標(biao)本(ben)不(bu)能(neng)太(tai)厚(hou)
，如(ru)太(tai)厚(hou)激(ji)發(fa)光(guang)大(da)部(bu)分(fen)消(xiao)耗(hao)在(zai)標(biao)本(ben)下(xia)部(bu)
，而(er)物(wu)鏡(jing)直(zhi)接(jie)觀(guan)察(cha)到(dao)的(de)上(shang)部(bu)不(bu)充(chong)分(fen)激(ji)發(fa)。另(ling)外(wai)，細(xi)胞(bao)重(zhong)迭(die)或(huo)雜(za)質(zhi)掩(yan)蓋(gai)，影(ying)響(xiang)判(pan)斷(duan)。

(四)封裱劑

封裱劑常用甘油
，必須無自發熒光，無色透明
，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去。所以
，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸鹽緩衝液的等量混合液作封裱劑。

(五)鏡油

yibananshiyeyingguangxianweijingheyongyoujingguanchabiaobenshi，bixushiyongjingyou，zuihaoshiyongtezhidewuyingguangjingyou，yekeyongshangshuganyoudaiti，yetishilayekeyong，zhishizheguanglvjiaodi
，duituxiangzhilianglveyouyingxiang。

三、使用熒光顯微鏡的注意事項

(1)嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。

(2)應在暗室中進行檢查。進入暗室後，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出強光穩定後，眼睛完全適應暗室，再開始觀察標本。

(3)防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡。

(4)檢查時間每次以1～2h為宜
，超過90min
，超高壓汞燈發光強度逐漸下降
，熒光減弱；標本受紫外線照射3～5min後，熒光也明顯減弱
；所以


，最多不得超過2～3h。

(5)yingguangxianweijingguangyuanshoumingyouxian，biaobenyingjizhongjianzha，yijieshengshijian，baohuguangyuan。tianreshi

，yingjiadianshansanrejiangwen，xinhuandengpaoyingcongkaishijiujilushiyongshijian。dengximiehouyuzaiyongshi，xudaidengpaochongfenlengquehoucainengdianran。yitianzhongyingbimianshucidianranguangyuan。

(6)標本染色後立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發。

(7)熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“一”—無或可見微弱熒光。“ ”—僅能見明確可見的熒光。“ ”—可見有明亮的熒光。“ ”—可見耀眼的熒光。

四、熒光圖像的記錄方法

熒ying光guang顯xian微wei鏡jing所suo看kan到dao的de熒ying光guang圖tu像xiang，一yi是shi具ju有you形xing態tai學xue特te征zheng
，二er是shi具ju有you熒ying光guang的de顏yan色se和he亮liang度du
，在zai判pan斷duan結jie果guo時shi，必bi須xu將jiang二er者zhe結jie合he起qi來lai綜zong合he判pan斷duan。結jie果guo記ji錄lu根gen據ju主zhu觀guan指zhi標biao，即ji憑ping工gong作zuo者zhe目mu力li觀guan察cha。作zuo為wei一yi般ban定ding性xing觀guan察cha，基ji本ben上shang可ke靠kao的de。隨sui著zhe技ji術shu科ke學xue的de發fa展zhan
，在zai不bu同tong程cheng度du上shang采cai用yong客ke觀guan指zhi標biao記ji錄lu判pan斷duan結jie果guo
，如ru用yong細xi胞bao分fen光guang光guang度du計ji，圖tu像xiang分fen析xi儀yi等deng儀yi器qi。但dan這zhe些xie儀yi器qi記ji錄lu的de結jie果guo，也ye必bi須xu結jie合he主zhu觀guan的de判pan斷duan。

熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)攝(she)影(ying)技(ji)術(shu)對(dui)於(yu)記(ji)錄(lu)熒(ying)光(guang)圖(tu)像(xiang)十(shi)分(fen)必(bi)要(yao)，由(you)於(yu)熒(ying)光(guang)很(hen)易(yi)褪(tui)色(se)減(jian)弱(ruo)，要(yao)即(ji)時(shi)攝(she)影(ying)記(ji)錄(lu)結(jie)果(guo)。方(fang)法(fa)與(yu)普(pu)通(tong)顯(xian)微(wei)攝(she)影(ying)技(ji)術(shu)基(ji)本(ben)相(xiang)同(tong)。隻(zhi)是(shi)需(xu)要(yao)采(cai)用(yong)高(gao)速(su)感(gan)光(guang)膠(jiao)片(pian)如(ru)ASA200以上或24。以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物

，在紫外光下照射30s
，熒光亮度降低50%。所(suo)以(yi)，曝(pu)光(guang)速(su)度(du)太(tai)慢(man)，就(jiu)不(bu)能(neng)將(jiang)熒(ying)光(guang)圖(tu)像(xiang)拍(pai)攝(she)下(xia)來(lai)。一(yi)般(ban)研(yan)究(jiu)型(xing)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)都(dou)有(you)半(ban)自(zi)動(dong)或(huo)全(quan)自(zi)動(dong)顯(xian)微(wei)攝(she)影(ying)係(xi)統(tong)裝(zhuang)置(zhi)。標(biao)本(ben)的(de)製(zhi)作(zuo)方(fang)法(fa)樣(yang)品(pin)須(xu)經(jing)過(guo)石(shi)蠟(la)包(bao)埋(mai)切(qie)片(pian)
，然(ran)後(hou)用(yong)鐵(tie)礬(fan)蘇(su)木(mu)精(jing)染(ran)色(se)，普(pu)通(tong)光(guang)鏡(jing)觀(guan)察(cha)效(xiao)果(guo)還(hai)可(ke)以(yi)．
作熒光觀察需用熒光染料DAPI染色
，

石蠟切片的過程：

1.取材:刀片要求鋒利而薄,組織厚度約2—3mm,大小1.5×1.5×0.2～0.3cm為宜.取材時間越快越好.

2.固定:組織取下後應立即放入10%福爾馬林(相當於4%甲醛)固定.

注意:(1).固定液量應為組織塊體積的40倍.

(2)固定時間固定時間與使用的固定液種類和組織塊大小,溫度等有關.一般為3—24h.

(3)固定溫度大多可在室溫固定,在低溫(4℃)時間應延長.

(4)固定容器應大些.

3.漂洗:流水衝洗2—10h.

4.脫水:從低濃度酒精到高濃度酒精.

70%(數分鍾)→80%(60-120’)→90%(60-120’)→95%(60-120’)→95%(60-120’)→100%(60-120’)→100%(60-120’).

5.透明:組織塊脫水後必須經過一種既能與酒精混合又能溶解石蠟的溶劑,而使石蠟進入組織塊.常用二甲苯,一般浸泡30m即可.

6.浸蠟:組織經透明後在熔化的石蠟內浸漬的過程稱浸蠟.一般需經2—3次浸漬才能完成,總時間為3—4h.用於浸蠟的石蠟熔點為52—56℃.

7.包埋:先將熔化的石蠟倒入包埋框再用加熱的鑷子將組織塊放入.包埋麵必須平整.包埋後石蠟稍凝後可移入冷水或冰箱中加速凝固.

8.切片:修塊→切片→展片→撈片→烤片.

也可作冰凍切片．

熒光染料的配製：

儲藏液：1mg/mldapi(DMSO、去離子水
、pbs都可以溶解)

工作液：通常1μg/ml

染色時須避光

，10min左右

用pbs衝去多餘染液即可觀察。