dangjianliyaopindeweishengwuxiandujianzhashi，yingjinxingkongzhijunjianzhafangfadeyanzheng，yiquerensuocaiyongdefangfashiheyugaiyaopindedekongzhijunjianzhafangfaceding。ruoyaopindezufenhuoyuanjianyantiaojianfashenggaibiankenengyingxiangjianyanjieguoshi
，jianyanfangfayingjinxingzhongxinyanzheng。yanzhengshiyanyekeyugongshipindekongzhijunjianzhatongshijinxing。

1.3.1.驗證用菌株 

大腸埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】

金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】

乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】

驗證實驗所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍幹燥菌種為0 代），並采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。  

1.3.2.菌液製備 

大腸埃希菌
、金黃色葡萄球菌
、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至10ml營養肉湯培養基中，35～37℃培養18～24小時
；分別取培養液 1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5~10-7，製成每1ml含菌數10～100cfu的菌懸液。   

1.3.3. 陰性菌對照組

設立陰性菌對照組是為了驗證該控製菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。  

1.3.4.試驗組

1.3.4.1.常規法

◆ 大腸埃希菌 取相當於1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu
，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～100cfu
，35～37℃培養18～24小時，取此培養物按《微生物限度檢查SOP》大腸埃希菌項下規定檢查。

◆大腸菌群 取含適量（不少於10ml）的膽鹽乳糖發酵培養基管3支
，分別加入含供試品1g或1ml 、0.1g或0.1ml
、含供試品0.001g或0.001ml的供試液，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～100cfu，35～37℃培養18～24小時，按《微生物限度檢查SOP》大腸菌群項下規定檢查。

◆沙門氏菌 取供試品10g或10ml，直接或處理後接種至適量（不少於200ml）的營養肉湯培養基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對照加入沙門菌 10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu

，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規定檢查。

◆銅綠假單胞菌 取相當於1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照加入銅綠假單胞菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規定檢查。 

◆ 金黃色葡萄球菌 取相當於1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中
，陽性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌 10～100cfu，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》金黃色葡萄球菌項下規定檢查。

1.3.4.2. 培養基稀釋法 供試品有抑菌作用，放大培養基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由於容器體積限製，一般放大到500ml或1000ml，本法適用於抑菌作用不強的樣品。

1.3.4.3. 薄膜過濾法 采(cai)用(yong)薄(bo)膜(mo)過(guo)濾(lv)法(fa)時(shi)
，取(qu)規(gui)定(ding)量(liang)供(gong)試(shi)液(ye)，過(guo)濾(lv)
，衝(chong)洗(xi)，試(shi)驗(yan)菌(jun)應(ying)加(jia)在(zai)最(zui)後(hou)一(yi)次(ci)衝(chong)洗(xi)液(ye)中(zhong)，過(guo)濾(lv)後(hou)
，注(zhu)入(ru)培(pei)養(yang)基(ji)或(huo)取(qu)出(chu)濾(lv)膜(mo)接(jie)入(ru)增(zeng)菌(jun)培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)。 

1.3.4.4. 離心沉澱集菌法 取規定量供試液
，如供試液含許多藥渣，先以500轉/分鍾離心3~5分鍾，取全部上清液，再以3000轉/分離心20分鍾
，取下麵1ml液體，並將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一並移入同瓶增菌液中，培養，本法適用於中度抑菌作用的樣品。 

1.3.4.5.中和法 zaigongshipinrongyezhongjiaruxiangyingdezhongheji，yijianchugongshipinzhongyijunchengfendezuoyong
，zhonghejiyingduiweishengwuwuduxing，yuyijunchengfenjiehehoudechanwuyingduiweishengwuyiwuduxing，huoyouduxingdanbuyingxiangdaijianjundejianchu。  

1.3.5.結果判斷 

至少應進行3次(ci)獨(du)立(li)平(ping)行(xing)試(shi)驗(yan)。陰(yin)性(xing)菌(jun)對(dui)照(zhao)組(zu)不(bu)得(de)檢(jian)出(chu)陰(yin)性(xing)對(dui)照(zhao)菌(jun)。若(ruo)試(shi)驗(yan)組(zu)檢(jian)出(chu)試(shi)驗(yan)菌(jun)
，照(zhao)該(gai)供(gong)試(shi)液(ye)製(zhi)備(bei)方(fang)法(fa)和(he)控(kong)製(zhi)菌(jun)檢(jian)查(zha)法(fa)進(jin)行(xing)該(gai)供(gong)試(shi)品(pin)控(kong)製(zhi)菌(jun)的(de)檢(jian)查(zha)
；若試驗組未檢出試驗菌，應采用自然沉降法
、培養基稀釋法、離心沉澱集菌法、薄膜過濾法
、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證。 

2.驗證的實施 

2.1細菌、黴菌及酵母菌計數方法驗證記錄及控製菌檢驗方法驗證記錄(見附件)。

2.2.分析數據，綜合整個驗證過程

，得出驗證結論。 

2.3.驗證過程中發生的異常情況
，按照《偏差處理程序》進行處理。 

3.相關文件

《微生物限度檢查SOP》

4.再驗證

4.1.藥品的組分發生改變可能影響檢驗結果時。 

4.2.驗證時檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時。