在RIA中，標記抗原質量的優劣，直接影響測定結果
，必須製備比放射性強、純度高的標記抗原

，並保持免疫活性不受喪失。

　　一、同位素的選擇

　　同tong位wei素su有you穩wen定ding性xing和he放fang射she性xing兩liang種zhong。放fang射she性xing同tong位wei素su可ke利li用yong其qi衰shuai變bian時shi放fang出chu的de放fang射she線xian進jin行xing測ce量liang
，這zhe種zhong測ce量liang較jiao靈ling敏min而er方fang便bian

，故gu多duo用yong放fang射she性xing同tong位wei素su。標biao記ji抗kang原yuan，常chang用yong的de放fang射she性xing同tong位wei素su有you3H
、14C、131I和125I等。在使用上各有其優缺點
，可根據所進行的放射免疫分析的類型特點，標記物製備和供應情況以及實驗室設備條件等作適當的選擇（表8-1）。大多數抗原分子中都含有C
、H等原子，所以用14C或3H標記不改變抗原的結構及其免疫學活性，且14C

、3H半衰期長，所標記的抗原長時間放置後仍可使用

，這都是其優點。14C或3H標記的不足之處是操作較繁瑣

，並難以獲得高比放射性的標記物
；3H及14C放出的都是弱β射she線xian，需xu用yong較jiao昂ang貴gui的de液ye體ti閃shan爍shuo計ji數shu器qi方fang能neng獲huo得de較jiao高gao效xiao率lv的de測ce量liang，且qie測ce定ding操cao作zuo也ye較jiao麻ma煩fan。但dan某mou些xie抗kang原yuan用yong放fang射she性xing碘dian標biao記ji容rong易yi喪sang失shi免mian疫yi化hua學xue或huo生sheng物wu學xue活huo性xing者zhe，則ze仍reng以yi采cai用yong3H或14C標記物為佳。

表8-1 標記抗原常用的放射性同位素及其性質

　　大多數抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改變了抗原的分子結構
，往往容易損傷抗原的免疫化學活性；且(qie)放(fang)射(she)性(xing)碘(dian)的(de)半(ban)衰(shuai)期(qi)較(jiao)短(duan)，標(biao)記(ji)物(wu)放(fang)置(zhi)後(hou)因(yin)衰(shuai)變(bian)使(shi)放(fang)射(she)性(xing)降(jiang)低(di)，因(yin)而(er)需(xu)要(yao)經(jing)常(chang)製(zhi)備(bei)標(biao)記(ji)物(wu)或(huo)要(yao)求(qiu)能(neng)定(ding)期(qi)提(ti)供(gong)放(fang)射(she)性(xing)碘(dian)標(biao)記(ji)都(dou)能(neng)適(shi)用(yong)，放(fang)射(she)性(xing)碘(dian)放(fang)出(chu)γ—射(she)線(xian)，用(yong)一(yi)般(ban)晶(jing)體(ti)閃(shan)爍(shuo)計(ji)數(shu)器(qi)就(jiu)能(neng)獲(huo)得(de)較(jiao)高(gao)效(xiao)率(lv)而(er)精(jing)確(que)的(de)測(ce)量(liang)，測(ce)量(liang)操(cao)作(zuo)也(ye)很(hen)簡(jian)單(dan)。由(you)於(yu)這(zhe)些(xie)突(tu)出(chu)的(de)優(you)點(dian)
，目(mu)前(qian)在(zai)放(fang)射(she)免(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)中(zhong)
，使(shi)用(yong)放(fang)射(she)性(xing)碘(dian)標(biao)記(ji)物(wu)最(zui)多(duo)。

　　從應用角度來看，131I和125I又各有其優缺點
，可根據實驗的要求

、儀器的條件和放射性碘製劑的規格等條件合理選用。但相對而言，125I有較多的優點，一是半衰期適中，允許標記化合物的商品化及貯存應用一段時間；二是它隻發射28keV能量的X射線和35keV能量的γ射線，而無β粒子，因而輻射自分解少
，標記化合物有足夠的穩定性。放射性碘適用於放射免疫分析許多對象（包括蛋白質
、肽類、固醇類、核酸類以及環型核苷酸衍生物等）的標記
，且操作簡單，一般實驗室都不難做到。

　　二、蛋白質與多肽激素的放射性碘標記

　　要製備高比度、高純度與免疫化學活性好的標記物
，首先要有高純度、良(liang)好(hao)免(mian)疫(yi)活(huo)性(xing)的(de)抗(kang)原(yuan)。用(yong)作(zuo)放(fang)射(she)標(biao)記(ji)加(jia)網(wang)免(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)的(de)特(te)異(yi)性(xing)

，所(suo)以(yi)若(ruo)用(yong)純(chun)度(du)不(bu)高(gao)的(de)抗(kang)原(yuan)作(zuo)標(biao)記(ji)，則(ze)標(biao)記(ji)後(hou)必(bi)須(xu)采(cai)取(qu)適(shi)當(dang)的(de)步(bu)驟(zhou)除(chu)去(qu)雜(za)質(zhi)，以(yi)獲(huo)得(de)高(gao)純(chun)度(du)的(de)標(biao)記(ji)物(wu)。標(biao)記(ji)對(dui)象(xiang)的(de)純(chun)化(hua)應(ying)盡(jin)量(liang)采(cai)用(yong)溫(wen)和(he)的(de)方(fang)法(fa)，否(fou)則(ze)在(zai)純(chun)化(hua)操(cao)作(zuo)中(zhong)已(yi)受(shou)潛(qian)在(zai)性(xing)損(sun)傷(shang)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)（這時表麵上活性可能還是良好的），再(zai)經(jing)標(biao)記(ji)反(fan)應(ying)時(shi)所(suo)受(shou)的(de)損(sun)傷(shang)
，活(huo)性(xing)就(jiu)會(hui)顯(xian)著(zhu)降(jiang)低(di)，影(ying)響(xiang)以(yi)後(hou)的(de)放(fang)射(she)分(fen)析(xi)結(jie)果(guo)。有(you)了(le)好(hao)的(de)純(chun)抗(kang)原(yuan)，還(hai)要(yao)采(cai)用(yong)適(shi)當(dang)方(fang)法(fa)加(jia)以(yi)標(biao)記(ji)
，盡(jin)量(liang)獲(huo)取(qu)高(gao)比(bi)放(fang)射(she)性(xing)

、而又能保持良好的特異免疫化學活性的標記物。這些都是放射免疫分析能取得高特異性和高靈敏度的關鍵問題。

　　多肽激素與蛋白質多用碘標記
，最常用的是125I。碘化反應的基本過程如下：通過氧化劑的作用，使碘化物（125I-）氧化成的碘分子（125I2）

，再與多肽激素、蛋(dan)白(bai)質(zhi)分(fen)子(zi)中(zhong)的(de)酪(lao)氨(an)酸(suan)殘(can)基(ji)發(fa)生(sheng)碘(dian)化(hua)作(zuo)用(yong)。所(suo)以(yi)不(bu)管(guan)采(cai)用(yong)哪(na)一(yi)種(zhong)放(fang)射(she)性(xing)碘(dian)標(biao)記(ji)法(fa)，標(biao)記(ji)的(de)化(hua)合(he)物(wu)內(nei)部(bu)必(bi)須(xu)有(you)碘(dian)原(yuan)子(zi)可(ke)結(jie)合(he)的(de)基(ji)團(tuan)，即(ji)結(jie)構(gou)上(shang)要(yao)含(han)有(you)酪(lao)胺(an)基(ji)或(huo)組(zu)織(zhi)胺(an)殘(can)基(ji)。凡(fan)蛋(dan)白(bai)質(zhi)
、肽(tai)類(lei)等(deng)抗(kang)原(yuan)
，在(zai)結(jie)構(gou)上(shang)含(han)有(you)上(shang)述(shu)基(ji)團(tuan)的(de)可(ke)直(zhi)接(jie)用(yong)放(fang)射(she)性(xing)碘(dian)進(jin)行(xing)標(biao)記(ji)。如(ru)不(bu)含(han)上(shang)述(shu)基(ji)團(tuan)的(de)

，放(fang)射(she)性(xing)碘(dian)無(wu)法(fa)標(biao)記(ji)，必(bi)須(xu)在(zai)這(zhe)些(xie)化(hua)合(he)物(wu)的(de)結(jie)構(gou)上(shang)連(lian)接(jie)上(shang)述(shu)基(ji)團(tuan)後(hou)才(cai)能(neng)進(jin)行(xing)碘(dian)標(biao)記(ji)。

　　因此影響蛋白質、多肽碘化效率的因素，主要決定於蛋白質、多肽分子中酪氨酸殘基的數量及它們在分子結構中暴露的程度
；此外，碘化物的用量
、反應條件（pH、溫度
、反應時間等）及所用氧化劑的性質等也有影響。

　　常用的標記方法有：

　　（一）氯胺T法

　　氯胺T法標記效率高、重複性好、試劑便宜易得
，是目前使用最多的碘標記方法。

　　1．原理氯氨—T（Chloramine－－T）是(shi)一(yi)種(zhong)溫(wen)和(he)的(de)氧(yang)化(hua)劑(ji)，在(zai)水(shui)溶(rong)液(ye)中(zhong)產(chan)生(sheng)次(ci)氯(lv)酸(suan)，可(ke)使(shi)碘(dian)陰(yin)離(li)子(zi)氧(yang)化(hua)成(cheng)碘(dian)分(fen)子(zi)。這(zhe)活(huo)性(xing)碘(dian)可(ke)取(qu)代(dai)肽(tai)鏈(lian)上(shang)酪(lao)氨(an)酸(suan)苯(ben)環(huan)上(shang)羥(qiang)基(ji)位(wei)的(de)一(yi)個(ge)或(huo)兩(liang)個(ge)氫(qing)

，使(shi)之(zhi)成(cheng)為(wei)含(han)有(you)放(fang)射(she)性(xing)碘(dian)化(hua)酪(lao)氨(an)酸(suan)的(de)多(duo)肽(tai)鏈(lian)。

 

　　2．方法以125I—AVP的製備為例。

　　（1）碘化反應：AVP5μg+0.5mol/l PB50μl（pH7.5）+1251800μCi,混合後
，加入新配置的Ch—t 30μg/15μl0.05mol/l PB, pH7.5。迅速振蕩混勻
，室溫下反應40s。

　　（2）終止碘化反應：加入還原劑偏重亞硫酸鈉40μg/20μl0.05mol/l PB, pH7.5,以終止碘化反應。

　　（3）Bio—Gel P2層析純化：將碘化反應混合液注入Bio—Gel P2柱
，用0.1n HAC溶液洗脫
，分部收集，每2min收集一管，共收集60管。

　　（4）放射性測量：測定各收集管的放射性，出現兩個峰，第一峰為125I—AVP
，第二峰為遊離碘鹽峰。第一個峰中計算最高的幾管，留下備用。

　　為了解標記抗原的質量，每次碘標記後應計算出碘的利用率，標記上多少放射性碘，以及每微克抗原結合上多少放射性碘。

　　（5）標記抗原的貯存：經純化與檢查後的標記物、加入1/8體積的異丙醇
，分成若幹小份，置於鉛罐中，在-20℃以下的冰箱中貯存備用
，應避免反複凍融。標記抗原在貯存中是不穩定的，這是因為：一是脫碘
，標記的碘從原來位置上脫落，變成遊離碘；二是蛋白損傷、變性，成為聚合大分子或斷鍵成小分子碎片。由於上述原因，使B/F明顯降低，標準曲線斜率變小
，以致不能使用，故需分離純化，其方法是用Sephadex G100長柱（40～80cm ）過柱

，洗脫後出現3個峰。第1個峰分子量大，是蛋白變性的聚合的大分子
，尚保留部分抗原決定簇
，免疫活性弱；第2個峰是純抗原的蛋白峰，免疫活性好
；第3個峰是遊離125I或小分子碎片
，不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰，免疫活性好；第3個峰是遊離125I或小分子碎片


，不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰，其性能類似於新鮮標記的抗原。分離純化的方法解決了標記抗原的貯存
、長期使用問題，特別對來之不易的抗原更顯得重要。

　　2．注意事項

　　（1）放射性碘源的選用：無載體的131I或125I均可用於碘化標記，但應盡量選用新鮮的
、比放射強度高的、含還原劑量少的放射性碘源。碘源的比放射強度最好≥50～100mCi/ml
，至少也要>30mCi/ml
，否則加入碘源的容量要增加，隨著帶入碘源中含有的還原劑（為放射性碘源運輸保存所需加入）量liang也ye增zeng加jia，這zhe將jiang會hui顯xian著zhu降jiang低di碘dian利li用yong率lv及ji標biao記ji蛋dan白bai比bi放fang射she強qiang度du。放fang置zhi較jiao久jiu和he放fang射she性xing碘dian源yuan，一yi方fang麵mian因yin衰shuai變bian致zhi比bi放fang射she強qiang度du降jiang低di
，另ling一yi方fang麵mian因yin水shui的de輻fu射she化hua學xue產chan物wu增zeng多duo（主要是131I源）

，都會降低標記時的碘利用率。放射性碘源含還原劑（如Na2S2O5等）量多時
，會抵消氯胺T的作用，降低碘利用率，甚至導致標記完全失敗。放射性碘源要用無載體的
，標記所用全部用具和試劑必須不含碘；隻(zhi)要(yao)有(you)極(ji)少(shao)量(liang)的(de)碘(dian)的(de)汙(wu)染(ran)，非(fei)放(fang)射(she)性(xing)碘(dian)就(jiu)會(hui)稀(xi)釋(shi)放(fang)射(she)性(xing)碘(dian)
，使(shi)放(fang)射(she)性(xing)碘(dian)利(li)用(yong)率(lv)顯(xian)著(zhu)降(jiang)低(di)。為(wei)了(le)便(bian)於(yu)放(fang)射(she)性(xing)防(fang)護(hu)和(he)除(chu)汙(wu)染(ran)，以(yi)及(ji)減(jian)少(shao)射(she)線(xian)對(dui)蛋(dan)白(bai)質(zhi)分(fen)子(zi)的(de)損(sun)傷(shang)
，標(biao)記(ji)投(tou)入(ru)的(de)放(fang)射(she)碘(dian)量(liang)不(bu)宜(yi)過(guo)大(da)，一(yi)般(ban)以(yi)<5mCi為宜。

　　（2）放射性碘與多肽、蛋白質用量的比例：這比例對標記結果的影響很大。如上述原因，一般標記時放射性投入量不宜過多
，示蹤實驗室中常規每次隻用1～2mCi，因而放射性碘與多肽
、蛋白質用量的比值主要靠標記時投入的多肽
、蛋白質用量來控製。當投入的放射碘量一定時
，多肽
、蛋白質用量多（即I/多肽、蛋白質比值低）
，能獲得高碘利用率，但所得標記蛋白比放射強度低
；相反多肽、蛋白質用量少（即I/多肽
、蛋白質比值高）

，則碘利用率降低，但所得標記多肽
、蛋白比放射性隨此比值變化都有較大的變動；而當此比值<1後，則碘利用率再下降的幅率較小，標記多肽
、蛋白比放射性也不會再增加多少。

　　（3）氯胺T與偏重亞硫酸鈉的用量及碘化反應時間：氧化碘化標記法中，會導致失活的最主要原因是氧化還原。氯胺T是氧化劑，早期用氯胺T法作碘化標記時氯胺T用量都比較大，或碘化反應時間較長
，結果導致蛋白質結構和活性的嚴重損傷。氯胺T用量大，或長時間進行碘化反應
，結果並不能使碘利用率和標記多肽、蛋白質比放射強度提高多少，反而使標記多肽
、蛋白活性下降。當用不含還原劑或還原劑很少的放射性碘源時，試以各種蛋白質（包括白蛋白、球蛋白
、ACTH
、胰島素等）作微量標記，當氯胺T用量為20μg/0.1ml反應液
、0～20。C反應20s
，碘利用率都已接近或達到最大峰，再加大氯胺T用量和延長反應時間是沒有必要的。隨放射性碘源中還原劑增多

，氯胺T用量也應增加
，以達到預期的碘利用率，但決不應盲目加大氯胺T用量和延長碘化反應時間（通常反應時間不要超過1min）
，否則會導致標記多肽、蛋白質嚴重失活，不能用於實驗。當然，減少氯胺T用量要在了解放射性碘源還原劑含量的基礎上，否則碘源中還原劑量較多，雙盲目減少氯胺T用量
，就會使標記失敗。一般用125I標記時，氯胺T用量要適當加大。加入氯胺T後必須迅速混勻，以防標記不均勻。氯胺T與偏重亞硫酸鈉溶液要新配製的。

　　氯胺T用量減少了
，Na2S2O5用量也就可以隨之減少。為保證按時終止碘化反應，實驗時加入Na2S2O5一般都是過量的。氯胺T用量大時，加入Na2S2O5的剩餘量也就會隨之增加
，這就可能加重某些對還原劑敏感的蛋白質或多肽生物活性的損傷。為此，Na2S2O5用量也不應過多。隻要藥品沒有變質、試劑是新配的，以重量計算Na2S2O5加入量與氯胺T相同就足以保證終止碘化反應（按反應克分子濃度計算
，Na2S2O5/氯胺T重量比約0.4），不要盲目加大用量，並應迅速將標記多肽、蛋白質從反應液中分離出來
，以盡量減少多肽、蛋白質活性的損傷。

　　某些蛋白質或多肽對氯胺T較敏感，還可進一步減少氯胺T用量


、縮短碘化反應時間、降低反應溫度，以保護蛋白質的活性。這對一些較容易喪失活性蛋白質或多肽的碘標記十分重要。

　　（4）碘化反應體積：係指加入Na2S2O5終止反應前液體的總量。碘化反應體積愈小，局部反應物濃度愈高，所得碘利用率和標記多肽、蛋白比放射強度就愈高。所以，標記應采用比放射標記效果。當反應液量少（<0.2～0.3ml）時
，反應體積對碘利用率和標記多肽、蛋白質比放射強度的高低影響較大
；當反應液量大（>0.5～1.0ml）時則影響較小。微量氯胺T法放射碘標記時，一般多控製碘化反應體積<100μl。

　　（5）碘化反應溫度：溫度升高，碘化反應速度加快，碘利用率有所增加。但總的來看
，反應溫度的影響不很大，一般從0℃到20℃碘利用率相差不過百分之幾，故一般在室溫下進行標記操作就可能獲得重複性好的結果。有些蛋白質或肽類極易喪失活性，則可在0℃進行碘化反應。

　　（6）碘化反應的pH值：受氧化劑氧化生成的活性碘，對多肽鏈的酪氨酸基苯環羥基鄰位的碘化作用，最適pH是7.3～7.8之間。當pH變化時，碘化位置也會發生變化，例如pH值較高時，組氧酸的咪唑環也可被碘化；當pH4～5shi，huoxingdiannengxunsuyanghuaseansuanjishengchengqiangjiyinduo，daozhitailianduanlie。zhexiedouhuiyingxiangdanbaizhihuoduotaidefangshexingdianhuafanying
，huoyinqijiangjiehuoshihuo。yincizuofangshexingdianhuabiaojishi，chufangshexingdianyuanwai，suoyoudeshijidouyingyongshidangdehuanchongyepeizhi，baozhengdianhuafanyingzaizuijiapH條件下進行。

　　（7）微量蛋白質或多肽的吸附損失：jiemiandexifusunshi，zaishiyongdaliangdanbaizhihuoduotaileishishikeyihulvede，danzuoweiliangfabiaojishitourudedanbaizhihuoduotaileizhizaiweikeshenzhihaokeshenzhihaoweikeshuiping
，jiemianxifudaozhidesunshijiubunenghulve。liruzhibei131I—ACTH時，所用ACTH濃度低到50Pg/ml時
，因表麵吸附可損失10%～30%，甚至高達75%。改變pH
、加入非特異性載體蛋白
、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器時，能減少吸附，但不能完全消除。一般殘留在反應管和滴管上的放射性為投入總放射性的2%～8%、殘留在層析柱上折占5%～10%。殘(can)留(liu)量(liang)隨(sui)標(biao)記(ji)蛋(dan)白(bai)比(bi)放(fang)射(she)性(xing)強(qiang)度(du)而(er)直(zhi)線(xian)增(zeng)減(jian)，殘(can)留(liu)者(zhe)幾(ji)乎(hu)全(quan)部(bu)都(dou)是(shi)標(biao)記(ji)蛋(dan)白(bai)。由(you)此(ci)可(ke)見(jian)

，微(wei)量(liang)蛋(dan)白(bai)質(zhi)或(huo)多(duo)肽(tai)受(shou)吸(xi)附(fu)而(er)損(sun)失(shi)的(de)量(liang)是(shi)不(bu)容(rong)忽(hu)略(lve)的(de)。由(you)於(yu)微(wei)量(liang)蛋(dan)白(bai)質(zhi)、多肽會被顯著吸附而丟失，所以標記時投入蛋白質、多肽量過微（如<2μg）也是不適宜的
，否則標記蛋白質

、多肽的收回率會太低，並在計算上會造成較大的誤差。

　　（8）不同蛋白質
、多肽碘化標記的差別：由(you)於(yu)不(bu)同(tong)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)和(he)多(duo)肽(tai)分(fen)子(zi)中(zhong)含(han)有(you)的(de)酪(lao)氨(an)酸(suan)數(shu)目(mu)不(bu)同(tong)
，而(er)且(qie)其(qi)空(kong)間(jian)結(jie)構(gou)也(ye)不(bu)相(xiang)同(tong)，分(fen)子(zi)中(zhong)的(de)酪(lao)按(an)酸(suan)殘(can)基(ji)有(you)的(de)容(rong)易(yi)發(fa)生(sheng)碘(dian)化(hua)反(fan)應(ying)
，有(you)的(de)就(jiu)不(bu)容(rong)易(yi)碘(dian)化(hua)，因(yin)此(ci)同(tong)樣(yang)條(tiao)件(jian)下(xia)進(jin)行(xing)碘(dian)化(hua)標(biao)記(ji)，不(bu)同(tong)蛋(dan)白(bai)質(zhi)或(huo)多(duo)肽(tai)對(dui)碘(dian)的(de)利(li)用(yong)率(lv)是(shi)不(bu)相(xiang)同(tong)的(de)。不(bu)同(tong)蛋(dan)白(bai)質(zhi)經(jing)碘(dian)化(hua)標(biao)記(ji)後(hou)生(sheng)物(wu)活(huo)性(xing)受(shou)損(sun)的(de)情(qing)況(kuang)也(ye)各(ge)不(bu)相(xiang)同(tong)。例(li)如(ru)ACTH、促性腺激素釋放激素（GRH）、促黃體激素釋放激素（LRH）等多肽
，碘化標記後容易喪失激素活性或與受體結合的活性；而AFP及人絨毛膜促性腺激素（HCG）等的碘化標記，則較容易保存良好的免疫化學活性。

　　盡管不同多肽
、蛋白度的碘化標記結果有所差別，但上述討論的因素對不同多肽
、蛋白質碘化標記的影響有共同的規律。掌握了這些因素，就容易成功地獲得合格的標記物。

　　不同多肽、蛋白質的分子量大小
、理化性質各不相同

，放射碘化標記反應後，可根據具體情況采取不同的方法將標記蛋白質（或多肽）與未反應的遊離放射性碘及受損傷的標記物分開，常用的方法有凝膠過濾
、離子交換層析、吸附層析
、各種電泳法等。

　　（二）乳過氧化物酶法（LPO）

　　本法反應溫和，對抗原
、抗體免疫活性影響小，已被廣泛應用。缺點是標記率較低，一般為20～40%。

　　1．原理此法是利用乳過氧化物酶（Lactoperoxidase）有促進微量過氧化氫對125I-的氧化作用，生成125I+
，並標記在多肽、蛋白質酪氨酸分子上。

　　2．方法以標記蛋白質抗原為例。

　　（1）反應液組成：蛋白質2～5μg溶於磷酸緩衝液10～25μl中，加入Na125i 1m Ci10μl、乳過氧化物酶溶液25ng10μl
、H2O2200ng10μl；

　　（2）在室溫保溫7min；

　　（3）加入H2O2200ng10μl；

　　（4）過7min再加入H2O23μl；

　　（5）保溫7min後，加入0.5ml


、10mmol/L巰基乙醇以停止反應；

　　（6）10min後加入NaI載體溶液1ml ；

　　（7）按常規方法分離純化。

　　3．注意事項

　　（1）LPO質量好壞，可直接影響標記率

，LPO應在使用前新鮮配製，以防酶活性降低。

　　（2）LPO用量應小於總蛋白質用量的1%，以減少酶自身碘化而帶入的放化雜質。

　　（3）碘化反應速率分析表明，酶的催化速度很快。

　　（4）碘化反應在pH4.0～8.5較寬範圍內均可進行

，最適pH值應依據蛋白質本身性質而定。

　　（5）H2O2應保持低濃度
，如高於0.1mmol/L，對酶的活性將有抑製作用。

　　（三）Iodogen碘化法

　　此法具有標記率高、反應體積小（3ml水平）
、可用低濃度的125I原料、對多肽激素和蛋白質的免疫活性損失小、穩定等優點，係常規的碘化方法之一。

　　1．原理　用Iodogen為氧化劑
，對蛋白質和多肽抗原進行碘化標記，把125I直接引進分子中的酪氨酸殘基上。標記過程中被標記樣品不與Iodogen混合，標記後取出樣品即停止反應，不使用任何還原劑。

　　2．方法

　　（1）標記之前，先把Iodogen溶於有機溶劑
，塗於管底，並使之幹燥。

　　（2）標記時，將蛋白質溶液10～20μg/10μl0.5mol/L,pH7.5PB置於反應管中

，反應管置於冰浴中。碘化時，125I與蛋白質克分子之比例為1～1.2。反應時間在溫和的連續的攪拌下可達10min


，從反應管中轉移出反應混合液，使其反應停止。反應液轉移到含有200μl0.01mol/L、pH7.2PB和0.15mol/L NaCl溶液中

，層析分離前再放置5min，使其未標記的碘離子還原成分子碘
，以避免在帶有緩衝液的柱中使白蛋白碘化。

　　3．注意事項

　　（1）塗有Iodogen的反應管，有氮氣中密封，並貯存在-20℃條件下，至少可用3個月。打開管
，使用時間很短。

　　（2）碘化反應時間，7min時標記率達最高
，10min時略有減少。PH6.0～8.5時，標記率最高。

　　（3）Iodogen與蛋白質的比率是標記率的函數。最大的標記率是1克分子的Iodogen與8克分子或再多量之比。

　　（四）酰化試劑（Bolton和Hunter試劑）法

　　1．原理這個方法用酰化劑3－－（4-羥苯基）丙酸—N琥珀酰胺酯（Bolton—Hunter試劑）做連接試劑，將125I標記在羥苯基的2
，5位置上，再將琥珀酰胺酯水解，通過一個酰氨鍵將3－－（4—羥基—5—125I—苯基）接在蛋白或多肽的末端氨基上。

　　2．方法125I—Bolton—Hunter試劑可用氯胺T法自行製備，出已有該試劑的苯溶液作為商品出售。使用時取一定量的標記酯（μmol 蛋白用3～5μmol標記酯），用氮氣吹除苯，投入欲標記蛋白5～10μg及緩衝液10～50μl,pH8.0～8.5為宜，在冰浴中反應15～30min後，加入多量氨基酸（如甘氨酸），使過量標記酯消耗掉以終止反應。

　　此ci法fa避bi免mian了le蛋dan白bai質zhi與yu氧yang化hua劑ji的de接jie觸chu
，又you避bi免mian了le與yu放fang射she性xing碘dian原yuan子zi的de直zhi接jie接jie觸chu，可ke防fang止zhi碘dian源yuan中zhong有you害hai物wu質zhi對dui蛋dan白bai質zhi的de損sun傷shang，適shi用yong於yu標biao記ji缺que乏fa酪lao氨an酸suan的de蛋dan白bai質zhi或huo酪lao氨an酸suan在zai活huo性xing中zhong心xin
，引yin入ru碘dian原yuan子zi後hou會hui引yin起qi蛋dan白bai質zhi的de失shi活huo。其qi缺que點dian是shi標biao記ji技ji術shu比bi較jiao複fu雜za，需xu要yao接jie觸chu較jiao多duo的de放fang射she性xing
，經jing二er步bu反fan應ying
，碘dian標biao記ji率lv比bi較jiao低di。一yi般ban認ren為wei此ci法fa不bu宜yi標biao記ji短duan肽tai
，而er適shi於yu分fen子zi量liang大da於yu1萬的蛋白質。

　　三、放射性標記化合物的純化與鑒定

　　（一）純化標記化合物的常用方法

　　不論使用何種製備方法，要獲得合格的標記化合物，都必須將反應物經過仔細的分離、純化。另外，一些標記化合物，經過一定時間的存放後
，往往會出現不純物，而需再純化。如碘標記生長激素（125－－HGH）,在剛標記的第2天

，從Sephadex G-100過濾譜上可見
，幾乎所有的碘化HGH都集中在峰II；保存1個月後
，峰II組份減少，峰I和峰III成分明顯增加，峰I是集聚的標記生長激素，而峰III是不具有免疫活性的放射性化學雜質（圖8－－3）。

 

圖8－3　125I—HGH的Sephadex G-100過濾譜

實線：新鮮製備的 125I—HGH　虛線：保存1個月的125I—HGH

　　標記化合物的純化方法
，除製備比活度低而化學量又較多的標記物可用重結晶、蒸餾、萃取等常規方法外
，一般需用微量分離技術，較方便的是層析法、離子交換法、凝膠過濾及高效液相層析法等。現以碘標記蛋白為例，說明以上各種方法的適用情況。

　　1．凝膠過濾法常用的是Sephadex G係列
，也有Biogel—P係列。分離標記蛋白與無機碘時，通常用Sephadex G—25或G—50，然後用G—100進一步純化。

　　2．離子交換法一般是製成離子交換層析柱，用於分離純化短肽標記物。

　　3．透析法　能將標記蛋白與小分子化合物很好地分離。

　　4．電泳法可用來分離單碘化、多碘化及已受損傷的蛋白質。

　　5．親和層析法利用蛋白質與其特異抗體或受體的結合來分離
、純化標記蛋白質。此法特異性強，保持生物活性好
，但操作較複雜。

　　6．高效液相層析法此法最大優點是分離效果好
、快速，但需特殊設備。

　　7．伴刀豆球蛋白A（ConA）吸附法ConA是一種植物凝集素，對糖蛋白有良好吸附能力，因此適於分離標記糖蛋白。吸附的標記糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脫。

　　（二）標記化合物的主要質量指標

　　作為示蹤劑及分析試劑的標記化合物，應具有比一般非標記化合物更高的質量要求。標記化合物的質量指標包括：放射性核純度、放射化學純度、放射性比活度
、生物活性和免疫活性以及標記位置和定量分布情況等。

　　1．放射性核純度及其檢查方法

　　（1）放射性核純芳可用下式表示：

　　放射性核純度（%）=所需放射性核素的活度/樣品的總放射性活度×100

　　（2）放射性核純度的檢查方法：每一種核素都有它的特征，即物理半衰期及射線能量，故可通過半衰期及射線能量的測定來鑒別所需放射性核的純度。

　　①測定半衰期法：如短半衰期放射性核素，一般可采用時間跟蹤法，每隔一定時間測量放射性一次，共測3～5個半衰期，以每次測得的放射性計數為縱座標
，時間為橫座標
，在半對數紙上作圖，並通過分析，可求出該放射性核素的純度。

　　②測定射線能量法：利用每一放射性核素的特征射線譜來檢查放射性核純度。γ發射體可用γ能譜儀，如檢測57Co和58Co的核純度：純β-發射體可用液閃儀
，調節　道寬及淬火校正後
，對如3H、14C、32P的核純度進行測量；而β、γ混雜垓素，則用吸收法測量，如99mrTc中母體雜質99mMo的含量測量，是通過適當厚度的鉛屏蔽，將99mTc 發射的能量為141ke V的γ射線減弱後
，測定99Mo發射的能量為739Kev 的γ射線。

　　2．放射化學純度及放化純度鑒定

　　（1）放射化學純度：放射性核素標記化合物都是以一定的化學形態存在的，所以：

　　放射化學純度（%）特定化學形態的放射性活度/樣品總放射性活度×100

　　放射化學純度受製備方法及原料的化學純度
、產物存放條件等影響
，一般放化純度控製在95%以上。

　　（2）放射化學純度的測定方法：原則是高效的化學分離與靈敏的放射性測量相結合。常用下列方法：

　　①放射層析法，又稱放射色譜法：本法是利用色譜技術使混合物中各組份分離
，然後測定各組份的放射性活度。它具有選擇性高
、分離效果好、操作簡便等優點，在放化純度鑒定中是一種重要的分析方法。最常用的是放射性紙層析法和放射性薄層層析法。

　　②放射性高效液相層析法：它對分離純化標記化合物及鑒定標記化合物的放化純度都有很大潛力，具有分析速度快
、分離效率高、適用範圍廣等特點（幾乎80%的有機化合物均可應用）。guanjianshiyaoxuanzeheshidegudingxiangheliudongxiang，shichanpinyuzazhifenli。zailiudongxiangzhong，beifenxiwugezufendenongdubianhuakeyongziwaihuoyingguangjianceqijiance，erqifangshexinghuodu，ketongshiyoufangshexingtanceyiceding。fangshexinghuoducedingzuijiandandeyizhongbanfa，shijiangxituoyefenbushouji，ranhouzaiγ儀或液閃儀上進行測量；另一種較理想的是連續測量，在洗脫液流通池外包圍一個固體閃爍探頭
，進行γ計數或在流通池前加一個三通混合室
，用另一個泵混入閃爍液，測定軟β射線。可以與紫外控測器的掃描圖，同步描繪出放射性的分布圖。

　　③放射性核素反稀釋法：取一定量（W1）已測定比活度（SO）的標記化合物（約0.1～10mg），用>1000倍化學量（W2）的純載體稀釋
，充分混勻後反複純化到比活度恒定不變（Sp），此標記化合物的放化純度值應為：

 

　　有時該值>100%時
，往往是由於所用載體化學純度不夠。因本法操作要求嚴格
，一般不作常規放化純度鑒定用。

　　3．化hua學xue純chun度du及ji化hua學xue量liang的de測ce定ding標biao記ji化hua合he物wu中zhong的de非fei放fang射she性xing化hua學xue雜za質zhi雖sui一yi般ban不bu會hui對dui示shi蹤zong結jie果guo帶dai來lai直zhi接jie幹gan擾rao
，然ran而er這zhe種zhong雜za質zhi的de含han量liang越yue多duo對dui標biao記ji化hua合he物wu在zai使shi用yong、存放過程中分解、bianxingdeyingxiangjiuyueda。ciwai
，yeyifaxianmouxiebiaojihuahewudehuaxuezazhihuigeishiyongdailaizhijieyingxiang。ruyongchuanbiaojileiguchunzuofangshemianyifenxishiji
，qizhongdehuaxuezazhihuiyingxiangbiaojikangyuanyukangtidejiehelv，shifenxilingmindujiangdi。yinci，duibiaojihuahewudehuaxuezazhihanliang，tongyangbixujiayikongzhi。

　　要yao製zhi得de化hua學xue純chun度du的de標biao記ji化hua合he物wu，最zui好hao是shi對dui可ke能neng產chan生sheng的de雜za質zhi加jia以yi防fang止zhi。這zhe要yao在zai冷leng試shi驗yan中zhong解jie決jue。因yin為wei冷leng試shi驗yan所suo得de產chan品pin是shi非fei放fang射she性xing的de，其qi化hua學xue純chun度du可ke用yong常chang規gui方fang法fa，如ru溶rong點dian、沸點測定
，NMR、紅外
、紫外譜分析等手段加以鑒定，得到合格產品後
，再按同樣方法及條件進行標記製備。

　　對(dui)於(yu)標(biao)記(ji)化(hua)合(he)物(wu)的(de)化(hua)學(xue)含(han)量(liang)，則(ze)必(bi)需(xu)在(zai)標(biao)記(ji)反(fan)應(ying)及(ji)一(yi)定(ding)純(chun)化(hua)步(bu)驟(zhou)後(hou)進(jin)行(xing)
，由(you)於(yu)需(xu)要(yao)高(gao)比(bi)活(huo)度(du)的(de)標(biao)記(ji)化(hua)合(he)物(wu)，往(wang)往(wang)樣(yang)品(pin)的(de)放(fang)射(she)性(xing)很(hen)強(qiang)，而(er)化(hua)學(xue)量(liang)極(ji)微(wei)（如某氘標記化合物，分子量為300，每分子上標記2個氘原子
，氘的同位素活度為99.8%，則理論上每25mCi（925MBq）的化學量還不足（130μg）,所以需用微量分析法才能測定其含量。一般而言，各種常規微量分析技術均可應用。目前大多用紫外分光

、熒光光度等進行含量測定。

　　4．放射性比活度及其測定

　　（1）放射性比活度簡稱比活度
，過去也稱比放射性。

　　比活度＝放射性活度／單位化學量

　　（2）比活度的理論值計算：每種放射性核素有一個比活度理論值，取決於該核素的半衰期和衰變常數。若N是1毫克原子（1mA）的總原子數，衰變常數λ（單位時間衰變的%）
，則

 

　　任何元素每1mA的原子數都相同，等於阿伏加德羅常數
，即6.023×1020個，故

 

　　若T1/2min為單位
，則上式的活度單位為dpm/mA,進行單位換算後為：

 

　　根據上式
，可計算出每種放射性核素比活度的理論值（常用放射性核素的比活度理論值見表8-2）。如果標記化合物每分子接上一個放射性核素原子，則以上原論值亦為該標記化合物的比活度（每毫摩爾的活度）理論值。

表8-2 一些常用放射性核素的比活度理論值

　　（亦即每分子一接一個該放射性核素原子的標記化合物的經活度理論值）

　　3放射性比活度測定方法

　　①直接測定計算法：將標記產品經分離純化後
，配成合適的溶液
，測定每毫升的放射性活度（如mCi/ml）及含量（μg/ml）從而計算其比活度。對於高經活度的標記物，化學含量甚低，一般需用光譜法，如紫外分光光度法測定其含量。

　　②層析掃描麵積計算法：一般應用紙層析或薄層層析

，將反應結果尚未分離的反應液點樣、展層
，然後在掃描儀上描繪放射性分布圖，根據描繪的麵積來進行計算
，如圖8-4。

 

圖8-4　放射層析掃描麵積計算比活度示意圖

1為標記物峰麵積：

S2S3為雜質峰及放射性原料峰麵積

　　先計算標記率：

　　放射性比活度的計算：若投入的待標記物重量為W，且100%轉化為標記物，則比活度=A·Y/W，其中A為投入的總放射性。

　　如果層析掃描儀有紫外監測器和放射性活度計數率儀可同步測定掃描，則直接可給出比活度。

　　③自身取代計算法：這是間接測定標記物比活度的方法。所測定的標記物，需是分離純化後可用於RIA或RRA標記試劑。

　　方法的原理是：作一條常規的RIA（或RRA）biaozhunquxian
，lingzuoyitiaobujiafeibiaojibiaozhunpin
，zhijiakangtihebutongliangbiaojishijidezishenqudaiquxian。liangzheyongtongyizhongkangti
，qiekangtiyongliangwanquanxiangtong。ruofanyingpinghenghoucedingjiehebufendefangshexing，taosuanchengsuojiazongfangshexing（注意：對標準曲線總說總放射性各管相同，對自身取代曲線來說各管不同，需分別換算）的百分數，即結合率B。由於兩條曲線所用抗體的質和量嚴格相同，標記物與非標記標準品與抗體親和力也相同，故B的大小就完全取決於各管中標記物和非標記標準品的總量。亦即若從兩標準曲線上取一點相同的B
，則

　　（標記物+標準品）標準曲線=（標記物）自身取代曲線

　　故由此便可直接計算標記試劑的化學含量並進一步求得比活度。為求準確度高
，可取我點B求出平均比活度。

　　用自身取代法測定標記化合物的比活度
，隻適用於RIA的標記抗原及受體的標記配基。使用時應注意：①標記物與未標記物對抗體（受體）的親和力應相同；②非特異性結合應較小

，且計算時應扣除；③製備標準曲線與自身取代曲線時，操作步驟應相同，特別是B與F分離的條件要一致。

　　5．生物活性、免疫活性測定

　　（10）生物活性、免疫活性測定的重要性：fangshexingbiaojihuahewuzuoweishizongjiyongyushengwutineideshizongyanjiu，huozuoweifenxishijiyongyushengwuhuoxingwuzhifenxi，douyaoqiubiaojihuahewubugaibianqiyuanyoudeshengwuhuoxinghemianyihuoxing。danggeihuawuyinrufangshexingyuanzi，jishi“同位素標記”大多需經過原子交換或化學反應及分離純化等物理化學處理，有可能造成光學構型及立體構型的改變而使標記物改變性質。“非同位素標記”，如蛋白質分子中引入碘原子，則更易引起蛋白質失活、變性。故測定放射性標記化合物的生物活性和免疫活性，對保證使用效果十分必要。

　　（2）生物活性和免疫活性測定的要求：需根據使用要求而定
，因為同一標記物其生物活性的變化與免疫活性的變化不一定相關
；同一標記激素


，其與受體結合能力的改變與抗體結合能力的改變也不一定平行。

　　（3）測定方法：測定標記蛋白質或多肽的生物活性和免疫活性常用的方法有下述幾種：

　　①物理化學方法：可用電泳法、吸xi附fu法fa及ji凝ning膠jiao過guo濾lv法fa等deng物wu理li化hua學xue方fang法fa來lai測ce定ding標biao記ji蛋dan白bai質zhi的de結jie構gou改gai變bian情qing況kuang，如ru標biao記ji後hou受shou損sun全quan傷shang的de蛋dan白bai質zhi在zai電dian泳yong時shi泳yong動dong性xing減jian少shao
，碘dian化hua受shou損sun的de多duo肽tai激ji素su在zai血xue紅hong蛋dan白bai塗tu碳tan上shang的de吸xi附fu性xing質zhi也ye有you改gai變bian
，而er蛋dan白bai質zhi變bian性xing聚ju合he時shi大da分fen子zi聚ju合he體ti將jiang在zai凝ning膠jiao過guo濾lv時shi不bu停ting留liu在zai凝ning膠jiao柱zhu上shang。這zhe些xie測ce定ding雖sui較jiao快kuai速su方fang便bian
，但dan對dui標biao記ji物wu的de生sheng物wu活huo性xing和he免mian疫yi活huo性xing的de嚴yan格ge判pan定ding來lai說shuo，還hai是shi很hen不bu夠gou的de。

　　②特異結合試驗：根(gen)據(ju)放(fang)射(she)性(xing)標(biao)記(ji)化(hua)合(he)物(wu)用(yong)於(yu)放(fang)射(she)免(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)等(deng)不(bu)同(tong)要(yao)求(qiu)，分(fen)別(bie)與(yu)其(qi)相(xiang)應(ying)抗(kang)體(ti)或(huo)受(shou)體(ti)進(jin)行(xing)特(te)異(yi)性(xing)結(jie)合(he)試(shi)驗(yan)。以(yi)放(fang)射(she)免(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)試(shi)劑(ji)為(wei)例(li)，測(ce)定(ding)其(qi)免(mian)疫(yi)活(huo)性(xing)的(de)方(fang)法(fa)是(shi)：xianguanchabiaojiwuyukangtidejiehelv，ruguojiehelvgao，shuomingkangyuandemianyihuoxingjiaohao。jinyibuguanchabiaojikangyuanyufeibiaojiduikangtiqinhelishifouyizhi，zuofazhiyishiyongbutongxishidudekangti，fenbieyubiaojikangyuanjiyubiaojikangyuanjiafeibiaojikangyuandehunhewujinxingteyijiehe，qizhonghunhewukangyuanzongnongduyaohedandushiyongfangshexingkangyuandenongduxiangtong。rudandushiyongbiaojikangyuan1.0ng,而混合抗原的總濃度亦為1.0ng，其中標記抗原為0.1ng，非標記抗原為0.9ng，比較兩者的結合率，如果基本相同
，說明標記抗原保持其原來的親和力，在標記等操作過程中未受到明顯損傷。如圖8-5中，A線與B線基本平行；如果標記抗原免疫活性已有降低，則如C線所示。

 

圖8-5　標記蛋白的免疫活性測定

　　A
；為標記抗原與血清的滴度曲線B：為非標記抗原（加入少量標記抗原）的滴度曲線；C：與A相同，但標記抗原免疫活性已有降低

　　③生物特性測定：如125I—纖xian維wei蛋dan白bai原yuan，可ke用yong凝ning血xue酶mei測ce定ding其qi可ke凝ning能neng力li
，與yu非fei標biao記ji物wu相xiang比bi，視shi是shi否fou有you改gai變bian。使shi用yong何he種zhong生sheng物wu特te性xing測ce定ding，根gen據ju標biao記ji物wu的de生sheng物wu性xing質zhi而er定ding。另ling外wai，上shang述shu特te異yi性xing結jie合he試shi驗yan

，如ru果guo受shou體ti作zuo異yi結jie合he劑ji
，也ye是shi檢jian驗yan用yong作zuoRRA或RBA分析試劑的標記物生物活性情況的有效方法。