溶(rong)血(xue)空(kong)斑(ban)形(xing)成(cheng)試(shi)驗(yan)的(de)基(ji)本(ben)原(yuan)理(li)是(shi)將(jiang)經(jing)綿(mian)羊(yang)紅(hong)細(xi)胞(bao)免(mian)疫(yi)小(xiao)鼠(shu)的(de)脾(pi)細(xi)胞(bao)與(yu)一(yi)定(ding)量(liang)的(de)綿(mian)羊(yang)紅(hong)細(xi)胞(bao)混(hun)合(he)，在(zai)補(bu)體(ti)參(can)與(yu)下(xia)
，使(shi)抗(kang)體(ti)形(xing)成(cheng)細(xi)胞(bao)周(zhou)圍(wei)那(na)些(xie)受(shou)到(dao)抗(kang)體(ti)分(fen)子(zi)致(zhi)敏(min)的(de)綿(mian)羊(yang)紅(hong)細(xi)胞(bao)溶(rong)解(jie)，形(xing)成(cheng)肉(rou)眼(yan)可(ke)見(jian)的(de)溶(rong)血(xue)空(kong)斑(ban)。根(gen)據(ju)所(suo)操(cao)作(zuo)的(de)方(fang)法(fa)不(bu)同(tong)可(ke)分(fen)為(wei)直(zhi)接(jie)溶(rong)血(xue)空(kong)斑(ban)試(shi)驗(yan)，間(jian)接(jie)溶(rong)血(xue)空(kong)斑(ban)試(shi)驗(yan)，瓊(qiong)脂(zhi)固(gu)相(xiang)法(fa)，小(xiao)室(shi)液(ye)相(xiang)法(fa)，單(dan)細(xi)胞(bao)層(ceng)法(fa)等(deng)等(deng)。下(xia)麵(mian)介(jie)紹(shao)直(zhi)接(jie)溶(rong)血(xue)空(kong)斑(ban)形(xing)成(cheng)試(shi)驗(yan)。

　　二、操作步驟：

　　1. 底層瓊脂平皿的製備：將1.4％瓊脂加熱融化後傾注於平皿內，每個平皿6ml，凝固後置濕盒37℃備用。

2. 0.7％瓊脂加熱融化後加入華氏管內，每管2ml，47～49℃水浴保溫備用。

　　3. 免疫小鼠脾細胞懸液製備：用4×10３ 個綿羊紅細胞(SRBC)鹽水懸液腹腔免疫小鼠，對照為等量生理鹽水。4天後
，小鼠拉脫頸椎處死，取出脾髒
，用RPMI164。洗一次後置平皿中不鏽鋼篩網上,用注射器針芯研磨成懸液,洗滌兩次,調整細胞數為3～8×10６/ml。台盼蘭染色查活細胞數應大於90％。置4℃冰箱備用。

　　4. 試驗平皿的製備：依次將預溫40℃左右的25％SRBC
、牼-SRBC吸收的滅活胎牛血清以及保存於4℃的脾細胞懸液各0.1ml加入預熱47～49℃的含0.7％瓊脂的華氏管中
，迅速混勻，立即傾注於鋪有底層瓊脂的平皿內，凝固後，置37℃孵育1小時。

5. 加入1∶5～1∶10稀釋的新鮮豚鼠血清0.5～1.0ml，使其均勻覆蓋表麵,再次置37℃溫育30分鍾
，即可用肉眼或借助於放大鏡進行空斑計數。

　　三、試劑和器材 免疫學實驗技術論壇  http://bbs.bbioo.com/forum-140-1.html

　　㈠ 試劑

　　1. 1.4％瓊脂：用pH7.4PBS配製。

　　2. 0.7％瓊脂：用pH7.4PBS配製

3. 25％SRBC鹽水懸液

4. RPMI1640

5. 胎牛血清，56℃30分鍾滅活，並經SRBC吸收

　　6. 補體：新鮮豚鼠血清，用前經SRBC吸收後，用RPMI1640稀釋。

　　㈡ 器材：玻璃平皿7×1.5cm，三角燒瓶，水浴箱(47～49℃)，華氏管


，1ml注射器
，不鏽鋼篩網，青黴素瓶，離心管，不同規格加樣器等。

四、注意事項：

　　1. 0.7％瓊脂必須置47～49℃水浴融態保溫。如溫度過高會導致SRBC溶血或所加入脾細胞的死亡。溫度過低則在操作過程中瓊脂發生凝固，影響上層瓊脂平板的製備

2. 離體的脾細胞應置4℃冰箱保存，防止抗體分泌和細胞死亡。

　　3. 在製備試驗平皿時，對於所有玻璃器皿和各種試劑 ，均需預溫
，牭1各種試劑加入華氏管後，應與0.7％瓊脂 迅速充分混勻，然後立即傾倒於底層瓊脂 上
，並避免傾入氣泡。

　　4. 加入的補體應均勻覆蓋於表層瓊脂上。

　　5. 製備底層平皿和試驗平皿時，均須將平皿置於水平台上，以保證瓊脂麵鋪平。