一、構造原理及結構

72型分光光度計是可見光分光光度計，波長範圍為420nm～700nm，它由三大部分組 成:磁飽和穩壓器

、光源、單色光器和測光機構、微電計。
72型分光光度計的基本依據是朗伯—比耳定律，它是根據相對測量原理工作的，即先選定某一溶劑作為標準溶液，設定其透光率為100%，被bei測ce試shi樣yang的de透tou光guang率lv是shi相xiang對dui於yu標biao準zhun溶rong液ye而er言yan的de，即ji讓rang單dan色se光guang分fen別bie通tong過guo被bei測ce試shi樣yang和he標biao準zhun溶rong液ye，二er者zhe能neng量liang的de比bi值zhi就jiu是shi在zai一yi定ding波bo長chang下xia對dui於yu被bei測ce試shi樣yang的de透tou光guang率lv。如ru圖tu所suo示shi，白bai色se光guang源yuan經jing入ru射she狹xia縫feng
、反射鏡和透光鏡後，變成平行光進入棱鏡，色散後的單色光經鍍鋁的反射鏡反射後，再經過透鏡並聚光於出射狹縫上

，狹縫寬度為0.32nm。反(fan)射(she)鏡(jing)和(he)棱(leng)鏡(jing)組(zu)裝(zhuang)在(zai)一(yi)可(ke)旋(xuan)轉(zhuan)的(de)轉(zhuan)盤(pan)上(shang)並(bing)由(you)波(bo)長(chang)調(tiao)節(jie)器(qi)的(de)凸(tu)輪(lun)所(suo)帶(dai)動(dong)
，轉(zhuan)動(dong)波(bo)長(chang)調(tiao)節(jie)器(qi)便(bian)可(ke)以(yi)在(zai)出(chu)光(guang)狹(xia)縫(feng)後(hou)麵(mian)選(xuan)擇(ze)到(dao)任(ren)一(yi)波(bo)長(chang)的(de)單(dan)色(se)光(guang)。單(dan)色(se)光(guang)透(tou)過(guo)樣(yang)品(pin)吸(xi)收(shou)池(chi)後(hou)由(you)一(yi)光(guang)量(liang)調(tiao)節(jie)器(qi)調(tiao)節(jie)為(wei)適(shi)度(du)的(de)光(guang)通(tong)量(liang)，最(zui)後(hou)被(bei)光(guang)電(dian)電(dian)池(chi)吸(xi)收(shou)

，轉(zhuan)換(huan)成(cheng)電(dian)流(liu)後(hou)由(you)微(wei)電(dian)計(ji)指(zhi)示(shi)，從(cong)刻(ke)度(du)標(biao)尺(chi) 上直接讀出透光率的值。
 
分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用於核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

二
、分光光度計的簡單原理

分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)采(cai)用(yong)一(yi)個(ge)可(ke)以(yi)產(chan)生(sheng)多(duo)個(ge)波(bo)長(chang)的(de)光(guang)源(yuan)，通(tong)過(guo)係(xi)列(lie)分(fen)光(guang)裝(zhuang)置(zhi)，從(cong)而(er)產(chan)生(sheng)特(te)定(ding)波(bo)長(chang)的(de)光(guang)源(yuan)
，光(guang)源(yuan)透(tou)過(guo)測(ce)試(shi)的(de)樣(yang)品(pin)後(hou)
，部(bu)分(fen)光(guang)源(yuan)被(bei)吸(xi)收(shou)，計(ji)算(suan)樣(yang)品(pin)的(de)吸(xi)光(guang)值(zhi)，從(cong)而(er)轉(zhuan)化(hua)成(cheng)樣(yang)品(pin)的(de)濃(nong)度(du)。樣(yang)品(pin)的(de)吸(xi)光(guang)值(zhi)與(yu)樣(yang)品(pin)的(de)濃(nong)度(du)成(cheng)正(zheng)比(bi)。

1、核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶於緩衝液的寡核苷酸，單鏈
、雙鏈DNA
，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。 每種核酸的分子構成不一，因此其換算係數不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的係數。如：1OD的吸光值分別相當於50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA
，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測(ce)試(shi)後(hou)的(de)吸(xi)光(guang)值(zhi)經(jing)過(guo)上(shang)述(shu)係(xi)數(shu)的(de)換(huan)算(suan)，從(cong)而(er)得(de)出(chu)相(xiang)應(ying)的(de)樣(yang)品(pin)濃(nong)度(du)。測(ce)試(shi)前(qian)，選(xuan)擇(ze)正(zheng)確(que)的(de)程(cheng)序(xu)


，輸(shu)入(ru)原(yuan)液(ye)和(he)稀(xi)釋(shi)液(ye)的(de)體(ti)積(ji)，爾(er)後(hou)測(ce)試(shi)空(kong)白(bai)液(ye)和(he)樣(yang)品(pin)液(ye)。然(ran)而(er)，實(shi)驗(yan)並(bing)非(fei)一(yi)帆(fan)風(feng)順(shun)。讀(du)數(shu)不(bu)穩(wen)定(ding)可(ke)能(neng)是(shi)實(shi)驗(yan)者(zhe)最(zui)頭(tou)痛(tong)的(de)問(wen)題(ti)。靈(ling)敏(min)度(du)越(yue)高(gao)的(de)儀(yi)器(qi)，表(biao)現(xian)出(chu)的(de)吸(xi)光(guang)值(zhi)漂(piao)移(yi)越(yue)大(da)。

事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定範圍內變化，即儀器有一定的準確度和精確度。如EppendorfBiophotometer的準確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩衝液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩衝液，如TE，可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：youyuyangpinzhongbukebimiancunzaiyixiexixiaodekeli，youqishihesuanyangpin。zhexiexiaokelidecunzaiganraoceshixiaoguo。weilezuidachengdujianshaokeliduiceshijieguodeyingxiang，yaoqiuhesuanxiguangzhizhishaodayu0.1A
，吸光值最好在0.1-1.5A。在此範圍內，顆粒的幹擾相對較小，結果穩定。

從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試範圍）。最後是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現負值
；混合液不能存在氣泡
，空白液無懸浮物
，否則讀數漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大
；換算係數和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。

除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度
，如 A 260 / A 280的比值，用於評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是 280 nm。純淨的樣品，比值大於 1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低於 1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A 230表示樣品中存在一些汙染物，如碳水化合物
，多肽
，苯酚等
，較純淨的核酸 A 260 / A 230 的比值大於 2.0。A 320檢測溶液的混濁度和其他幹擾因子。純樣品
，A 320 一般是 0。

2
、蛋白質的直接定量（UV法）
這種方法是在280 nm波長，直接測試蛋白。選擇 Warburg公式
，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。

蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然後直接測試蛋白質。由於緩衝液中存在一些雜質，一般要消除320 nm的“背景”信息
，設定此功能“開”。與測試核酸類似，要求 A 280 的吸光值至少大於 0.1A，最佳的線性範圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇 Warburg 公式顯示樣品濃度時
，發現讀數“漂移”。這是一個正常的現象。事實上

，隻要觀察A 280的吸光值的變化範圍不超過 1%，表明結果非常穩定。
漂移的原因是因為 Warburg公式吸光值換算成濃度，乘以一定的係數，隻要吸光值有少許改變

，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩定。

蛋白質直接定量方法
，適合測試較純淨、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對於比色法來說
，速度快

，操作簡單
；但是容易受到平行物質的幹擾，如DNA 的幹擾；另外敏感度低
，要求蛋白的濃度較高。

3、比色法蛋白質定量
蛋白質通常是多種蛋白質的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：氨基酸（如酪氨酸
，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應

，產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關，從而反應蛋白質濃度。

比色方法一般有 BCA
，Bradford，Lowry 等幾種方法。
Lowry 法：以最早期的 Biuret 反應為基礎
，並有所改進。蛋白質與Cu2+反應，產生藍色的反應物。但是與 Biuret相比，Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質的影響；含EDTA，Triton x-100

，ammonia sulfate 等物質的蛋白不適合此種方法。
BCA（Bicinchoninine acid assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液裏與Cu2+反應產生 Cu+
，後者與 BCA 形成螯合物
，形成紫色化合物，吸收峰在 562 nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關係極強，反應後形成的化合物非常穩定。相對於 Lowry 法，操作簡單，敏感度高。但是與 Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去汙劑的幹擾。

Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應，產生的有色化合物吸收峰595 nm。其最大的特點是
，敏感度好，是 Lowry 和 BCA 兩種測試方法的 2倍；操作更簡單，速度更快；隻需要一種反應試劑；化合物可以穩定1小時，方便結果；而且與一係列幹擾 Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對於去汙劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。

mouxiechucijiechubisefacedingdeyanjiuzhekenengweigezhongbisefacechudejieguobingbuyizhi，gandaomihuo，jiujinggaixiangxinnazhongfangfa？youyugezhongfangfafanyingdejituanyijixiansejituanbuyi，suoyitongshishiyongjizhongfangfaduitongyiyangpindechudeyangpinnongduwukebixing。liru：Keller 等測試人奶中的蛋白
，結果 Lowry，BCA測出的濃度明顯高於Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標準樣品不一致
，測試後的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質，以 BSA 作標準品，濃度1.34 mg / ml，以 a 球蛋白作標準品，濃度 2.64 mg /ml。因(yin)此(ci)
，在(zai)選(xuan)擇(ze)比(bi)色(se)法(fa)之(zhi)前(qian)，最(zui)好(hao)是(shi)參(can)照(zhao)要(yao)測(ce)試(shi)的(de)樣(yang)本(ben)的(de)化(hua)學(xue)構(gou)成(cheng)，尋(xun)找(zhao)化(hua)學(xue)構(gou)成(cheng)類(lei)似(si)的(de)標(biao)準(zhun)蛋(dan)白(bai)作(zuo)標(biao)準(zhun)品(pin)。另(ling)外(wai)，比(bi)色(se)法(fa)定(ding)量(liang)蛋(dan)白(bai)質(zhi)，經(jing)常(chang)出(chu)現(xian)的(de)問(wen)題(ti)是(shi)樣(yang)品(pin)的(de)吸(xi)光(guang)值(zhi)太(tai)低(di)，導(dao)致(zhi)測(ce)出(chu)的(de)樣(yang)品(pin)濃(nong)度(du)與(yu)實(shi)際(ji)的(de)濃(nong)度(du)差(cha)距(ju)較(jiao)大(da)。關(guan)鍵(jian)問(wen)題(ti)是(shi)，反(fan)應(ying)後(hou)的(de)顏(yan)色(se)是(shi)有(you)一(yi)定(ding)的(de)半(ban)衰(shuai)期(qi)，所(suo)以(yi)每(mei)種(zhong)比(bi)色(se)法(fa)都(dou)列(lie)出(chu)了(le)反(fan)應(ying)測(ce)試(shi)時(shi)間(jian)，所(suo)有(you)的(de)樣(yang)品(pin)（包括標準樣品），都必須在此時間內測試。時間過長
，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值zhi等deng都dou是shi影ying響xiang實shi驗yan的de重zhong要yao原yuan因yin。此ci外wai，非fei常chang重zhong要yao的de是shi，最zui好hao是shi用yong塑su料liao的de比bi色se法fa。避bi免mian使shi用yong石shi英ying或huo者zhe玻bo璃li材cai質zhi的de比bi色se杯bei
，因yin為wei反fan應ying後hou的de顏yan色se會hui讓rang石shi英ying或huo者zhe玻bo璃li著zhe色se，導dao致zhi樣yang品pin吸xi光guang值zhi不bu準zhun確que。

細菌細胞密度（OD 600）
shiyanshiquedingxijunshengchangmiduheshengchangqi，duogenjujingyanhemucetuiduanxijundeshengchangmidu。zaiyudaoyaoqiujiaogaodeshiyan

，xuyaocaiyongfenguangguangdujizhunquecedingxijunxibaomidu。OD600是(shi)追(zhui)蹤(zong)液(ye)體(ti)培(pei)養(yang)物(wu)中(zhong)微(wei)生(sheng)物(wu)生(sheng)長(chang)的(de)標(biao)準(zhun)方(fang)法(fa)。以(yi)未(wei)加(jia)菌(jun)液(ye)的(de)培(pei)養(yang)液(ye)作(zuo)為(wei)空(kong)白(bai)液(ye)，之(zhi)後(hou)定(ding)量(liang)培(pei)養(yang)後(hou)的(de)含(han)菌(jun)培(pei)養(yang)液(ye)。為(wei)了(le)保(bao)證(zheng)正(zheng)確(que)操(cao)作(zuo)，必(bi)須(xu)針(zhen)對(dui)每(mei)種(zhong)微(wei)生(sheng)物(wu)和(he)每(mei)台(tai)儀(yi)器(qi)用(yong)顯(xian)微(wei)鏡(jing)進(jin)行(xing)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)，做(zuo)出(chu)校(xiao)正(zheng)曲(qu)線(xian)。實(shi)驗(yan)中(zhong)偶(ou)爾(er)會(hui)出(chu)現(xian)菌(jun)液(ye)的(de)OD值(zhi)出(chu)現(xian)負(fu)值(zhi)，原(yuan)因(yin)是(shi)采(cai)用(yong)了(le)顯(xian)色(se)的(de)培(pei)養(yang)基(ji)，即(ji)細(xi)菌(jun)培(pei)養(yang)一(yi)段(duan)時(shi)間(jian)後(hou)
，與(yu)培(pei)養(yang)基(ji)反(fan)應(ying)，發(fa)生(sheng)變(bian)色(se)反(fan)應(ying)。另(ling)外(wai)
，需(xu)要(yao)注(zhu)意(yi)的(de)是(shi)，測(ce)試(shi)的(de)樣(yang)品(pin)不(bu)能(neng)離(li)心(xin)
，保(bao)持(chi)細(xi)菌(jun)懸(xuan)浮(fu)狀(zhuang)態(tai)。

分光光度計的重要配件 —— 比色杯
比色杯按照材質大致分為石英杯、bolibeiyijisuliaobei。genjubutongdeceliangtiji
，youbisebeihemaoxibisebeideng。yibanceshihesuanheziwaidingliangdanbai，juncaiyongshiyingbeihuozhebolibei
，danshibushihebisefaceding。yinweifanyingzhongderanliao（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用於在紫外範圍內測試樣品。

由(you)於(yu)另(ling)外(wai)測(ce)試(shi)的(de)樣(yang)品(pin)量(liang)不(bu)同(tong)
，所(suo)以(yi)一(yi)般(ban)分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)廠(chang)家(jia)提(ti)供(gong)不(bu)同(tong)容(rong)積(ji)的(de)比(bi)色(se)杯(bei)以(yi)滿(man)足(zu)用(yong)戶(hu)不(bu)同(tong)的(de)需(xu)求(qiu)。目(mu)前(qian)市(shi)場(chang)已(yi)經(jing)存(cun)在(zai)一(yi)種(zhong)既(ji)可(ke)用(yong)於(yu)核(he)酸(suan)、紫外蛋白質定量，亦可用於蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量僅需50μl
，比色杯單個無菌包裝，可以回收樣品。如Eppendorf UVette?塑su料liao比bi色se杯bei，是shi目mu前qian比bi色se杯bei市shi場chang上shang一yi個ge革ge新xin。隨sui著zhe生sheng命ming科ke學xue以yi及ji相xiang關guan學xue科ke發fa展zhan
，對dui此ci類lei科ke學xue的de實shi驗yan研yan究jiu提ti出chu更geng高gao的de要yao求qiu
，分fen光guang光guang度du計ji將jiang是shi分fen子zi生sheng物wu學xue實shi驗yan室shi不bu可ke缺que少shao的de儀yi器qi

，也ye成cheng為wei微wei生sheng物wu

、食品
、製藥等相關實驗室的必備設備之一。