概述

huaxuefaguangzuoweiyizhongfenxigongjudexiyinzhichujiuzaiyujiancedejiandanxing。huaxuefaguangdeshizhishizishenfaguang
，zheyiweizhehuaxuefaguangdefenxiceshiyiqizhixuyaotigongyizhongkeyijianceguangxinhaohejilujieguodefangfajiukeyile。zifaguangjianceyixuyaoyigebiguangdeyangpinshiheguangjianceqi。zuijiandandebianshixiangpianzhihuoX光片，甚至視覺檢測器都可以。

化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)的(de)簡(jian)單(dan)性(xing)使(shi)得(de)它(ta)的(de)應(ying)用(yong)很(hen)簡(jian)單(dan)並(bing)且(qie)完(wan)全(quan)可(ke)以(yi)自(zi)動(dong)化(hua)。但(dan)是(shi)它(ta)的(de)靈(ling)敏(min)度(du)又(you)是(shi)怎(zen)麼(me)樣(yang)的(de)呢(ne)
？化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)有(you)如(ru)下(xia)兩(liang)個(ge)內(nei)在(zai)的(de)優(you)勢(shi)：

1．絕大多數的樣品沒有“背景”信號，如它們自身不發光。

2．化學發光的檢測不是一個比例測試
，這是與熒光和吸收或比色測試不同的。在熒光測試中
，具有小的Stokes Shift的熒光基團非常難檢測。熒光很難從激發波長中分辨出來。

另外一個問題是，特別在樣品是渾濁的情況下有一部分雜光會進入到檢測器。

在吸收光測試上，其靈敏度受到限製的根本因素是需要在兩個相對較強的信號之間去區分一個較小的差別。

需(xu)要(yao)注(zhu)意(yi)的(de)是(shi)檢(jian)測(ce)器(qi)對(dui)光(guang)譜(pu)的(de)敏(min)感(gan)性(xing)近(jin)可(ke)能(neng)接(jie)近(jin)化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)的(de)光(guang)譜(pu)

，以(yi)得(de)到(dao)最(zui)大(da)化(hua)的(de)靈(ling)敏(min)度(du)。一(yi)般(ban)在(zai)自(zi)發(fa)光(guang)儀(yi)中(zhong)的(de)光(guang)電(dian)倍(bei)增(zeng)管(guan)對(dui)藍(lan)光(guang)有(you)最(zui)佳(jia)的(de)反(fan)應(ying)，對(dui)紅(hong)光(guang)的(de)末(mo)端(duan)光(guang)譜(pu)不(bu)太(tai)敏(min)感(gan)。固(gu)態(tai)檢(jian)測(ce)器(qi)對(dui)紅(hong)光(guang)有(you)較(jiao)好(hao)的(de)反(fan)應(ying)。

X光片廣泛用於記錄在尼龍膜、纖維素膜或PVDF膜上的化學發光印跡分析。但是我們需要牢記在心的是X光片僅能夠用於檢測紫外到藍光光譜範圍內的光信號，雖然有一些特殊的光片對增強的綠光有敏感性。

液體樣品的檢測

有一些特定的詞來描繪化學發光檢測：靈敏度、線性和動態範圍。每一個詞的意義如下：

1．靈敏度指的是某種東西可靠檢測的最低水平。“某種東西”shizhizaiyigefenxiceshizhongdeceshiwu。ceshiwushibeibiaojileyizhongkejiancededongxi，ruhuaxuefaguanghuahewuhuodeyizhongmei。fenxiwuyekeyishiyizhongtongguoyujuyoubiaojideqinhewuyouteyixingjiehefanyingerjiancedewuzhi。suoweidekekaojiancezhideshizhenduiyigekongbaiceshiyangpin，jianceqinenggouzhongfuganyingdaozuidishuipingdexinhao，erzhezhongxinhaoshiyousuojiancewubenshenchanshengde。

2．線性描述的是信號與分析檢測物濃度範圍之間的關係。理想的比例因子是常數
；信號點與分析檢測物是一條直線關係。標準曲線可以不是直線，如s形，仍是有用的。

3．動態範圍指的是被檢測物濃度與信號單一模式的變換範圍。它定義的是分析的工作範圍。

你期望通過化學發光得到什麼水平的靈敏度呢？答案不一定會滿足你的要求，“它是有條件的”。在zai很hen少shao情qing況kuang下xia，檢jian測ce器qi的de靈ling敏min度du或huo化hua學xue發fa光guang方fang法fa會hui是shi檢jian測ce的de局ju限xian因yin素su。現xian在zai的de檢jian測ce器qi可ke以yi達da到dao很hen高gao的de靈ling敏min度du。大da多duo數shu情qing況kuang下xia
，而er是shi其qi它ta的de一yi些xie因yin素su顯xian示shi了le分fen析xi檢jian測ce的de靈ling敏min度du。最zui通tong常chang的de是shi生sheng物wu成cheng分fen（抗體
、酶等）的非特異性結合到反應容器和支持物的表麵。例如，免疫分析，印跡實驗，核酸雜交和其它的酶聯結合實驗都是受製於此因素。

管和微孔板

玻璃、透明或半透明的塑料管、biseminshihuaxuefaguangceshibijiaolixiangdecailiao。lixiangdeshiguangnenggoutongguoyigepingmianranhouceshi，yijianshaobianjixiaoying。qumianyekeyishiyong，ruyuanzhuxingdeceshiguan。yongbutongdeceshiguanceshibijiaojieguo，zhexieguanbixushitongyishengchande，caikeyibijiaojieguo。

微孔板——conghuaxuefaguangfanyingzhongfashechudeguangshigexiangtongxingde，jizaigegefangxiangshangtongdengfashechulaide。ruguoyigehuaxuefanyingshizaitoumingdeweikongbanzhongdeweikongzhongjinxing，guangbujincongchuizhifangxiangfasan，haicongshuipingfangxiangfasanchulai。guanghenrongyidetongguogegekongzhijiandejianxihekongbi。guangjiaoqiangdekongjiuhuiganraoxianglindekong。yinci，huaxuefaguangceshiyibanbuyongtoumingweikongban。

不透明的微孔板和板條主要有兩種——白色和黑色。使用者需要注意的是黑色的因為有光吸收

，所以它的信號會比白色板有很明顯的減弱（將近10倍）。因yin為wei所suo有you的de孔kong是shi同tong等deng比bi例li的de收shou到dao影ying響xiang，所suo以yi不bu管guan他ta們men的de強qiang度du，定ding量liang並bing沒mei有you問wen題ti。白bai色se或huo黑hei色se板ban的de選xuan擇ze

，主zhu要yao是shi基ji於yu預yu期qi檢jian測ce信xin號hao的de強qiang弱ruo，白bai色se板ban用yong於yu檢jian測ce較jiao弱ruo光guang的de檢jian測ce，黑hei色se板ban用yong於yu檢jian測ce強qiang光guang的de檢jian測ce。黑hei色se板ban的de另ling一yi優you點dian就jiu是shi可ke以yi削xue弱ruo非fei特te異yi性xing結jie合he所suo帶dai來lai的de問wen題ti。

此(ci)外(wai)
，白(bai)色(se)板(ban)並(bing)不(bu)是(shi)完(wan)全(quan)同(tong)等(deng)不(bu)透(tou)明(ming)。為(wei)熒(ying)光(guang)設(she)計(ji)的(de)白(bai)板(ban)的(de)白(bai)色(se)素(su)比(bi)用(yong)於(yu)化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)的(de)白(bai)板(ban)的(de)要(yao)少(shao)的(de)多(duo)。在(zai)熒(ying)光(guang)檢(jian)測(ce)時(shi)，每(mei)檢(jian)測(ce)一(yi)次(ci)
，一(yi)般(ban)在(zai)針(zhen)對(dui)一(yi)個(ge)孔(kong)，消(xiao)除(chu)了(le)相(xiang)鄰(lin)孔(kong)之(zhi)間(jian)的(de)幹(gan)擾(rao)。白(bai)色(se)微(wei)孔(kong)板(ban)的(de)好(hao)壞(huai)很(hen)容(rong)易(yi)檢(jian)測(ce)
，隻(zhi)要(yao)在(zai)板(ban)的(de)後(hou)麵(mian)放(fang)上(shang)一(yi)隻(zhi)燈(deng)，然(ran)後(hou)看(kan)每(mei)個(ge)孔(kong)。如(ru)果(guo)穿(chuan)過(guo)的(de)燈(deng)光(guang)不(bu)僅(jin)僅(jin)是(shi)淡(dan)淡(dan)的(de)，那(na)麼(me)用(yong)於(yu)較(jiao)強(qiang)的(de)化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)底(di)物(wu)的(de)分(fen)析(xi)是(shi)會(hui)有(you)一(yi)些(xie)問(wen)題(ti)的(de)。

固相樣品的檢測（印跡膜）

X光片——它已經被認為是對固定在膜上的蛋白或核酸進行化學發光檢測的強有力的工具
，如Southern、Northern和Western雜交的化學發光檢測。此類商業化的產品已非常廣泛。

如果能夠控製好非特異性的結合，靈敏度是足夠的。如果不能很好控製，將會X光片上曝光過度。解決這個問題的最好策略是減少結合的試劑的量，例如抗體或類似物。曝光時間1到10分鍾通常是足夠顯現大多數的印跡。更長的很少能提高信號/背景。

關(guan)於(yu)靈(ling)敏(min)度(du)相(xiang)對(dui)的(de)方(fang)麵(mian)來(lai)講(jiang)，未(wei)得(de)到(dao)信(xin)號(hao)並(bing)不(bu)意(yi)味(wei)著(zhe)分(fen)析(xi)物(wu)的(de)不(bu)存(cun)在(zai)。任(ren)何(he)一(yi)種(zhong)光(guang)學(xue)用(yong)膜(mo)片(pian)都(dou)有(you)一(yi)個(ge)強(qiang)度(du)閾(yu)值(zhi)，在(zai)這(zhe)個(ge)閾(yu)值(zhi)之(zhi)上(shang)銀(yin)顆(ke)粒(li)的(de)光(guang)化(hua)學(xue)轉(zhuan)化(hua)才(cai)能(neng)成(cheng)功(gong)。否(fou)則(ze)會(hui)失(shi)敗(bai)，稱(cheng)之(zhi)為(wei)“可逆失敗”。在(zai)實(shi)際(ji)操(cao)作(zuo)中(zhong)
，化(hua)學(xue)發(fa)光(guang)信(xin)號(hao)低(di)於(yu)閾(yu)值(zhi)強(qiang)度(du)的(de)結(jie)果(guo)僅(jin)是(shi)簡(jian)單(dan)的(de)沒(mei)有(you)記(ji)錄(lu)。更(geng)長(chang)時(shi)間(jian)的(de)曝(pu)光(guang)也(ye)不(bu)能(neng)克(ke)服(fu)這(zhe)個(ge)問(wen)題(ti)。可(ke)以(yi)通(tong)過(guo)一(yi)些(xie)方(fang)法(fa)來(lai)改(gai)進(jin)
，在(zai)曝(pu)光(guang)之(zhi)前(qian)如(ru)把(ba)膜(mo)片(pian)放(fang)在(zai)氫(qing)氣(qi)和(he)氮(dan)氣(qi)的(de)混(hun)合(he)氣(qi)體(ti)中(zhong)預(yu)閃(shan)
，即(ji)用(yong)低(di)強(qiang)度(du)的(de)光(guang)短(duan)時(shi)間(jian)的(de)照(zhao)射(she)膜(mo)片(pian)
，以(yi)提(ti)高(gao)光(guang)學(xue)顆(ke)粒(li)的(de)光(guang)子(zi)。

CCD成像技術——最近
，基於CCD的影像係統已成為化學發光印跡結果獲得和記錄的好工具。這些係統在信號測試的動態範圍上表現出很好的效果。CCD的量度大小為3～4個級數，而X光片僅為1個級數。攝像時間短，並且可以獲得多個影像和容易存儲。雖然需要投入設備的購置費，但是可以節省膜片和其它的投入。

設備（光電倍增管）

在發光儀上，PMT為傳統的選擇。它們的優勢包括良好的靈敏度
，寬廣的動態範圍和較寬的光譜相應。因為PMT具有很低的暗電流，使得它們具有極佳的信噪比。

PMT有兩種基本模式——單光子計數和電流感應。有些複合係統是在每秒百萬個光子以下為單光子模式，超過之後為電流感應。

PMTdanguangzijishuxitongshichaolingminde。yongzheleijianceqizhuyaoshiweilemanzulingminduyaoqiujiaogaodeceshihedingliang。yuegaoyaoqiudelingmindu，jiageyuegao。yangpinceshishibixushiguangmibixingfeichanghaode。ruguoguangtaiqianghuisunhaiPMT。

PMT電流感應係統也能獲得較好的靈敏度
，經常用於比單光子計數係統檢測的更強的光。

對於選擇何種模式的PMTjianceqi，xuyaoyunideshijixuyaojieheqilaixuanze。xianzai，zheliangzhongjianceqidehuaxuefaguangyicaozuodoubijiaojiandan
，lingminduyedoubijiaohao。duiciyouyigezhengquedelijie，nijiukeyixuanzeyigebijiaoshihenideyingyongdeshebei。

PMT主要應用在液相中化學發光的檢測，儀器形式可以為管式和板式。其檢測結果單位值為RLU（Relative Light Unit），各個公司生產的產品其對RLU的定義會有所不同。

固態檢測

光(guang)電(dian)二(er)極(ji)管(guan)能(neng)夠(gou)感(gan)應(ying)比(bi)光(guang)電(dian)倍(bei)增(zeng)管(guan)所(suo)感(gan)應(ying)的(de)更(geng)強(qiang)的(de)光(guang)強(qiang)度(du)。對(dui)於(yu)那(na)些(xie)需(xu)要(yao)測(ce)試(shi)高(gao)強(qiang)度(du)光(guang)的(de)應(ying)用(yong)，選(xuan)擇(ze)這(zhe)樣(yang)的(de)檢(jian)測(ce)器(qi)比(bi)較(jiao)好(hao)。然(ran)而(er)，固(gu)態(tai)檢(jian)測(ce)器(qi)的(de)暗(an)電(dian)流(liu)比(bi)光(guang)電(dian)倍(bei)增(zeng)管(guan)一(yi)般(ban)要(yao)高(gao)很(hen)多(duo)。解(jie)決(jue)這(zhe)個(ge)問(wen)題(ti)的(de)方(fang)法(fa)之(zhi)一(yi)是(shi)通(tong)過(guo)Peltier或者是其它的熱電製冷設備冷卻固態檢測器。在0～30攝氏度範圍內

，固態檢測器的暗電流隨溫度的降低會急劇下降。冷卻的檢測器能夠整合1到100秒範圍內所檢測到光信號而不會被暗電流所覆蓋。

CCD和其它的固態檢測器擁有以下幾個內在的優點：

1
、在可見光譜範圍內
，固態檢測器有一個較好的光譜響應。發光反應發出紅光，甚至近紅外光。

2、CCD影ying像xiang係xi統tong可ke以yi對dui不bu同tong的de目mu標biao物wu進jin行xing檢jian測ce。基ji本ben上shang任ren何he一yi種zhong樣yang品pin或huo容rong器qi都dou可ke以yi適shi用yong，如ru微wei孔kong板ban，細xi菌jun測ce試shi管guan或huo細xi胞bao培pei養yang皿min，電dian泳yong凝ning膠jiao和he印yin跡ji膜mo。

3、單個PMT係統在測讀之前必須對樣品位置進行定位。樣品管重複多次帶到一個固定位置
，然後重複測讀。微孔板PMT測ce讀du儀yi依yi賴lai於yu微wei孔kong之zhi間jian的de標biao準zhun間jian隔ge，能neng夠gou按an照zhao一yi個ge預yu算suan好hao的de位wei置zhi移yi動dong微wei孔kong板ban
，由you此ci微wei孔kong一yi個ge接jie著zhe一yi個ge的de測ce讀du。而er攝she像xiang係xi統tong測ce讀du一yi個ge樣yang品pin不bu需xu要yao預yu先xian知zhi道dao它ta的de位wei置zhi，例li如ru膜mo上shang的de一yi個ge條tiao帶dai。影ying像xiang係xi統tong能neng夠gou把ba樣yang品pin的de濃nong度du和he位wei置zhi信xin息xi給gei出chu。

4、CCD影像係統能夠同時獲得大量樣品的信息。如對96、384或更多數目的微孔板的數據的同步收集並不是一個奢望。固態影像係統可以一次就獲得整個微孔板的影像和定量。

儀器設計者或終端使用者需要注意的是影像檢測器對於微孔板樣品的檢測存在一個重大的缺陷：三維的微孔板相比於二維檢測物（如膜）會(hui)產(chan)生(sheng)一(yi)個(ge)邊(bian)際(ji)效(xiao)應(ying)。因(yin)為(wei)光(guang)強(qiang)度(du)按(an)照(zhao)距(ju)離(li)平(ping)方(fang)的(de)倒(dao)數(shu)逐(zhu)漸(jian)變(bian)弱(ruo)，所(suo)以(yi)把(ba)攝(she)像(xiang)頭(tou)放(fang)到(dao)盡(jin)可(ke)能(neng)離(li)板(ban)近(jin)的(de)地(di)方(fang)由(you)此(ci)可(ke)以(yi)得(de)到(dao)最(zui)好(hao)的(de)結(jie)果(guo)。然(ran)而(er)，因(yin)為(wei)孔(kong)是(shi)有(you)深(shen)度(du)，最(zui)遠(yuan)孔(kong)的(de)整(zheng)個(ge)底(di)部(bu)就(jiu)可(ke)能(neng)看(kan)不(bu)到(dao)。這(zhe)個(ge)孔(kong)的(de)邊(bian)緣(yuan)部(bu)分(fen)的(de)光(guang)信(xin)號(hao)就(jiu)很(hen)可(ke)能(neng)檢(jian)測(ce)不(bu)到(dao)。

提(ti)高(gao)攝(she)像(xiang)頭(tou)將(jiang)削(xue)減(jian)檢(jian)測(ce)器(qi)所(suo)獲(huo)得(de)的(de)整(zheng)體(ti)的(de)光(guang)強(qiang)度(du)。幾(ji)何(he)計(ji)算(suan)模(mo)式(shi)可(ke)以(yi)拿(na)來(lai)應(ying)用(yong)以(yi)彌(mi)補(bu)邊(bian)際(ji)強(qiang)度(du)的(de)丟(diu)失(shi)
，但(dan)是(shi)外(wai)圍(wei)孔(kong)的(de)信(xin)噪(zao)比(bi)必(bi)然(ran)比(bi)中(zhong)央(yang)孔(kong)的(de)要(yao)差(cha)。

CCD應用最普遍的設備係統為帶製冷CCD的化學發光凝膠成像係統。為了提高檢測速度和通量，有時也把CCD應用到高通量的板式化學發光檢測儀上。

輔助設備

大多數研究用的發光儀和發光免疫分析儀都裝有一些輔助裝置，如樣品孵育
，樣品注射器，光學濾光片等。

1.、溫度控製——有時需要的結果進行比較
，會因為溫度的不同而收到幹擾。特別是在一些酶催化的“glow”型xing的de反fan應ying需xu要yao幾ji分fen鍾zhong才cai能neng達da到dao高gao峰feng，溫wen度du的de變bian化hua會hui導dao致zhi測ce試shi到dao的de強qiang度du發fa生sheng變bian化hua

，降jiang低di分fen析xi的de精jing確que性xing。如ru果guo能neng夠gou控kong製zhi樣yang品pin的de溫wen度du和he反fan應ying溫wen度du的de統tong一yi，可ke以yi使shi得de反fan應ying在zai固gu定ding條tiao件jian下xia進jin行xing。樣yang品pin發fa光guang強qiang度du可ke能neng由you幾ji個ge因yin素su造zao成cheng的de：溫度依賴的酶動力學和隨後的底物化學反應動力學。緩衝液的pH值加上溫度的影響可以引起信號的顯著變化。

2、單dan色se分fen光guang和he濾lv光guang片pian可ke以yi分fen離li特te定ding的de波bo長chang或huo光guang譜pu範fan圍wei的de光guang。在zai化hua學xue發fa光guang應ying用yong中zhong一yi般ban沒mei有you特te殊shu的de要yao求qiu，它ta們men是shi不bu需xu要yao的de。在zai同tong一yi個ge反fan應ying體ti係xi中zhong有you兩liang種zhong能neng夠gou發fa出chu不bu同tong光guang譜pu的de發fa光guang物wu
，其qi目mu的de是shi為wei了le分fen析xi檢jian測ce兩liang種zhong不bu同tong的de測ce試shi物wu。如ru在zai生sheng物wu化hua學xue發fa光guang能neng量liang共gong振zhen轉zhuan移yi中zhong
，就jiu用yong濾lv光guang片pian來lai分fen析xi蛋dan白bai質zhi的de相xiang互hu結jie合he。波bo長chang的de選xuan擇ze不bu免mian會hui降jiang低di檢jian測ce器qi上shang的de光guang通tong過guo量liang從cong而er倒dao是shi靈ling敏min度du的de損sun失shi。

3
、中性濾光片——使用中型濾光片可以是檢測設備的檢測範圍延伸2～3個數量級。由特製的淺灰玻璃組成，放置於樣品與監測器之間，這些濾鏡起到類似“太陽鏡”的作用將所有波長的光都以相同的因子進行減弱。使用此校正因子將測量得到的光校正到“真實”的強度。

4、注射器可以使得底物或啟動劑能夠以精確的時間加入。對於一個隨時間光信號產生變化的動力學樣品來說，這是非常重要的。