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1 流式細胞儀的概念及其發展曆史
1.1 流式細胞儀的基本概念
流式細胞儀（flow cytonletry，FCM）是對高速直線流動的細胞或生物微粒進行快速定量測定和分析的儀器，主要包括樣品的液流技術、細胞的計數和分選技術，計算機對數據的采集和分析技術等。流式細胞儀以流式細胞術為理論基礎，是流體力學、激光技術、電子工程學、分子免疫學、細胞熒光化學和計算機等學科知識綜合運用的結晶。流式細胞術是一種自動分析和分選細胞或亞細胞的技術。其特點是：測量速度快、被測群體大、可進行多參數測量，即對同一個細胞做有關物理、生物化學特性的多參數測量，且在統計學上有效。
1.2 流式細胞儀的發展簡史
最早的流式細胞儀雛形誕生於1934年，Moldavan提出使懸浮的單個血紅細胞流過玻璃毛細管，在亮視野下用顯微鏡進行計數，並用光電記錄裝置測量的設想。1953年Crosland-Taylor根據牛頓流體在圓形管中流動規律設計了流動室。其後又經過Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不斷改進，設計了光電檢測設備和細胞分選裝置、完成了計算機與流式細胞儀的物理連接及多參數數據的記錄和分析、開創了細胞的免疫熒光染色及檢測技術、推廣流式細胞儀在臨床上的應用。近20年來，隨著流式細胞儀及其檢測技術的日臻完善，人們越來越致力於樣品製備、細胞標記、軟件開發等方麵的工作，以擴大FCM的應用領域和使用效果。
宋平根的《流式細胞術的原理和應用》是迄今為止對流式細胞儀及其技術闡述的最為詳盡和透徹的中文著作。這本書非常詳細地介紹了流式細胞術的曆史、結構、原理、技術指標等，例舉了其在醫學和生物工程中的應用，非常適合從事此方麵專業研究的人。由於這本書是13年(nian)前(qian)出(chu)版(ban)的(de)，所(suo)以(yi)基(ji)本(ben)上(shang)沒(mei)有(you)涉(she)及(ji)植(zhi)物(wu)流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀(yi)檢(jian)測(ce)技(ji)術(shu)。此(ci)外(wai)對(dui)於(yu)隻(zhi)需(xu)要(yao)對(dui)流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀(yi)有(you)些(xie)基(ji)本(ben)認(ren)識(shi)的(de)人(ren)士(shi)來(lai)說(shuo)，這(zhe)本(ben)書(shu)太(tai)複(fu)雜(za)太(tai)深(shen)奧(ao)。謝(xie)小(xiao)梅(mei)主(zhu)要(yao)介(jie)紹(shao)了(le)流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀(yi)在(zai)生(sheng)物(wu)工(gong)程(cheng)中(zhong)的(de)應(ying)用(yong)。楊(yang)蕊(rui)概(gai)括(kuo)了(le)流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀(yi)的(de)工(gong)作(zuo)原(yuan)理(li)，簡(jian)單(dan)提(ti)及(ji)了(le)流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀(yi)的(de)應(ying)用(yong)。本(ben)文(wen)在(zai)分(fen)析(xi)這(zhe)三(san)篇(pian)論(lun)著(zhu)或(huo)文(wen)章(zhang)的(de)優(you)缺(que)點(dian)後(hou)，用(yong)比(bi)較(jiao)通(tong)俗(su)的(de)語(yu)言(yan)介(jie)紹(shao)了(le)掌(zhang)握(wo)流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀(yi)檢(jian)測(ce)技(ji)術(shu)必(bi)須(xu)了(le)解(jie)的(de)一(yi)些(xie)原(yuan)理(li)，並(bing)對(dui)目(mu)前(qian)市(shi)場(chang)上(shang)的(de)主(zhu)流(liu)型(xing)號(hao)進(jin)行(xing)了(le)客(ke)觀(guan)的(de)性(xing)能(neng)概(gai)括(kuo)。
2 流式細胞儀的工作原理和技術指標
2.1 流式細胞儀工作原理
除電源外，流式細胞儀主要由四部分組成：流動室和液流係統：激光源和光學係統；光電管和檢測係統；計算機和分析係統，其中流動室是儀器的核心部件。這四大部件共同完成了信號的產生、轉換和傳輸的任務。
2.1.1 信號的產生、轉換和傳輸
zaiyalizuoyongxia，qiaoyeguanzhongdeqiaoyebeichixubuduandiyaruliudongshi，xingchengyiguwendingdilianxudeyeliu，baozhengleyangbenyewendingdichuyuqiaoyeyeliudezhouxianshang，bingyidangexibaoxingshizhixiantongguojiguangzhaoshequ。jiguangzhaoshequyouchengceliangqu，shizhiyeliuyujiguangshuchuizhixiangjiaodedian。dangxibaoxiedaiyingguangsubiaojiwutongguojiguangzhaoshequshi，chanshengdaibiaoxibaoneibubutongwuzhi、不同波長的熒光信號，這些信號以細胞為中心，向空間360°立li體ti角jiao發fa射she，產chan生sheng散san射she光guang和he熒ying光guang信xin號hao。散san射she光guang不bu依yi賴lai任ren何he細xi胞bao樣yang品pin的de製zhi備bei技ji術shu，因yin此ci被bei稱cheng為wei細xi胞bao的de物wu理li參can數shu或huo固gu有you參can數shu。散san射she光guang又you包bao括kuo前qian向xiang角jiao散san射she和he測ce向xiang角jiao散san射she。前qian向xiang角jiao散san射she與yu被bei測ce細xi胞bao直zhi徑jing的de平ping方fang密mi切qie相xiang關guan，測ce向xiang角jiao散san射she光guang對dui細xi胞bao膜mo、胞質、核膜的折射率更敏感，可提供有關細胞內精細結構和顆粒性質的信息。熒光信號也有二種；yizhongshixibaozishenzaijiguangzhaoshexiafachudeweiruoyingguangxinhao，lingyizhongshijingguoteyiyingguangsubiaojihoudexibaoshoujifazhaoshehoudedaodeyingguangxinhao。zaimianyifenxizhongchangyaotongshitanceliangzhongyishangbochangdeyingguangxinhao，jiucaiyongerxiangsexingfanshejing，huoerxiangsexingfenguangqi，laiyouxiaodijianggezhongyingguangfenkai。
經熒光染色的細胞受到適合的光激發後產生的熒光是通過光電轉換器轉變成電信號而進行測量的。最常用的光電轉換器是光電倍增管（PMT）。從PMT輸(shu)出(chu)的(de)電(dian)信(xin)號(hao)需(xu)要(yao)經(jing)過(guo)放(fang)大(da)後(hou)才(cai)能(neng)輸(shu)入(ru)分(fen)析(xi)儀(yi)器(qi)。流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀(yi)中(zhong)一(yi)般(ban)備(bei)有(you)兩(liang)類(lei)放(fang)大(da)器(qi)。一(yi)類(lei)是(shi)線(xian)性(xing)放(fang)大(da)器(qi)，其(qi)輸(shu)出(chu)信(xin)號(hao)與(yu)輸(shu)入(ru)信(xin)號(hao)成(cheng)線(xian)性(xing)關(guan)係(xi)。線(xian)性(xing)放(fang)大(da)器(qi)適(shi)用(yong)於(yu)在(zai)較(jiao)小(xiao)範(fan)圍(wei)內(nei)變(bian)化(hua)的(de)信(xin)號(hao)以(yi)及(ji)代(dai)表(biao)生(sheng)物(wu)學(xue)線(xian)性(xing)過(guo)程(cheng)的(de)信(xin)號(hao)，如(ru)DNA測(ce)量(liang)等(deng)。另(ling)一(yi)類(lei)是(shi)對(dui)數(shu)放(fang)大(da)器(qi)，其(qi)輸(shu)出(chu)信(xin)號(hao)和(he)輸(shu)入(ru)信(xin)號(hao)之(zhi)間(jian)成(cheng)常(chang)用(yong)對(dui)數(shu)關(guan)係(xi)。在(zai)免(mian)疫(yi)學(xue)測(ce)量(liang)中(zhong)常(chang)使(shi)用(yong)對(dui)數(shu)放(fang)大(da)器(qi)。放(fang)大(da)後(hou)的(de)電(dian)信(xin)號(hao)被(bei)傳(chuan)送(song)到(dao)計(ji)算(suan)機(ji)，再(zai)經(jing)模(mo)一(yi)數(shu)轉(zhuan)換(huan)器(qi)傳(chuan)輸(shu)到(dao)微(wei)機(ji)處(chu)理(li)器(qi)形(xing)成(cheng)數(shu)據(ju)文(wen)件(jian)，保(bao)存(cun)在(zai)計(ji)算(suan)機(ji)上(shang)。保(bao)存(cun)在(zai)計(ji)算(suan)機(ji)上(shang)的(de)數(shu)據(ju)可(ke)在(zai)脫(tuo)機(ji)後(hou)再(zai)進(jin)行(xing)數(shu)據(ju)處(chu)理(li)和(he)分(fen)析(xi)。
2.1.2 流式細胞儀分選原理
並bing不bu是shi所suo有you的de流liu式shi細xi胞bao儀yi都dou具ju有you分fen選xuan功gong能neng。流liu式shi細xi胞bao儀yi的de分fen選xuan功gong能neng是shi由you細xi胞bao分fen選xuan器qi來lai完wan成cheng的de。由you噴pen嘴zui射she出chu的de液ye流liu柱zhu在zai電dian信xin號hao作zuo用yong下xia發fa生sheng振zhen動dong，斷duan裂lie形xing成cheng均jun勻yun的de小xiao液ye滴di。根gen據ju選xuan定ding的de某mou個ge參can數shu由you邏luo輯ji電dian路lu判pan明ming是shi否fou將jiang被bei分fen選xuan，而er後hou由you充chong電dian電dian路lu對dui選xuan定ding細xi胞bao液ye滴di充chong電dian，帶dai電dian液ye滴di攜xie帶dai細xi胞bao通tong過guo靜jing電dian場chang而er發fa生sheng偏pian轉zhuan，落luo入ru收shou集ji器qi中zhong。使shi用yong不bu同tong孔kong徑jing的de噴pen孔kong及ji改gai變bian液ye流liu速su度du，可ke能neng會hui改gai變bian分fen選xuan效xiao果guo。從cong參can數shu測ce定ding經jing邏luo輯ji選xuan擇ze再zai到dao脈mai衝chong充chong電dian需xu要yao一yi段duan延yan遲chi時shi間jian。精jing確que測ce定ding延yan遲chi時shi間jian是shi決jue定ding分fen選xuan質zhi量liang的de關guan鍵jian，可ke根gen據ju具ju體ti要yao求qiu進jin行xing適shi當dang調tiao整zheng。
2.1.3 數據的顯示和分析
數(shu)據(ju)處(chu)理(li)主(zhu)要(yao)包(bao)括(kuo)數(shu)據(ju)的(de)顯(xian)示(shi)和(he)分(fen)析(xi)。單(dan)參(can)數(shu)直(zhi)方(fang)圖(tu)是(shi)使(shi)用(yong)最(zui)多(duo)的(de)圖(tu)形(xing)顯(xian)示(shi)形(xing)式(shi)，既(ji)可(ke)用(yong)於(yu)定(ding)性(xing)分(fen)析(xi)，又(you)可(ke)用(yong)於(yu)定(ding)量(liang)分(fen)析(xi)。單(dan)參(can)數(shu)直(zhi)方(fang)圖(tu)是(shi)由(you)X、Y二方向組成的二維平麵圖。橫座標X是所測的熒光或散射光的強度，用“道數”（Channel No．）來表示。選擇的放大器類型不同，標度不同。縱座標Y通tong常chang表biao示shi被bei測ce細xi胞bao的de絕jue對dui數shu目mu。正zheng常chang情qing況kuang下xia，數shu據ju分fen析xi得de到dao的de圖tu形xing為wei具ju有you一yi個ge或huo若ruo幹gan個ge峰feng的de曲qu線xian圖tu。對dui曲qu線xian圖tu的de解jie釋shi應ying該gai具ju體ti問wen題ti具ju體ti分fen析xi。
除直方圖外，數據顯示方式還包括二維點圖、二維等高圖、假jia三san維wei圖tu和he列lie表biao模mo式shi等deng。二er維wei點dian圖tu也ye是shi比bi較jiao常chang用yong的de數shu據ju顯xian示shi類lei型xing。它ta顯xian示shi兩liang個ge獨du立li參can數shu與yu細xi胞bao相xiang對dui數shu之zhi間jian的de關guan係xi，也ye是shi二er維wei平ping麵mian圖tu，橫heng縱zong坐zuo標biao可ke以yi根gen據ju自zi己ji選xuan定ding的de被bei測ce參can數shu自zi行xing決jue定ding，點dian的de位wei置zhi表biao明ming了le細xi胞bao和he顆ke粒li具ju有you的de二er個ge被bei測ce參can數shu的de數shu值zhi。二er維wei點dian圖tu所suo提ti供gong的de信xin息xi量liang要yao大da於yu單dan參can數shu直zhi方fang圖tu。
數(shu)據(ju)分(fen)析(xi)的(de)方(fang)法(fa)大(da)體(ti)可(ke)分(fen)為(wei)參(can)數(shu)法(fa)和(he)非(fei)參(can)數(shu)法(fa)兩(liang)大(da)類(lei)。當(dang)被(bei)檢(jian)測(ce)的(de)生(sheng)物(wu)學(xue)係(xi)統(tong)能(neng)夠(gou)用(yong)某(mou)種(zhong)數(shu)學(xue)模(mo)型(xing)時(shi)則(ze)多(duo)使(shi)用(yong)參(can)數(shu)方(fang)法(fa)。非(fei)參(can)數(shu)分(fen)析(xi)法(fa)不(bu)用(yong)對(dui)顯(xian)示(shi)的(de)圖(tu)像(xiang)做(zuo)任(ren)何(he)假(jia)設(she)，也(ye)不(bu)采(cai)用(yong)數(shu)學(xue)模(mo)型(xing)，分(fen)析(xi)程(cheng)序(xu)可(ke)以(yi)很(hen)簡(jian)單(dan)，也(ye)可(ke)能(neng)很(hen)複(fu)雜(za)。臨(lin)床(chuang)醫(yi)學(xue)較(jiao)常(chang)使(shi)用(yong)非(fei)參(can)數(shu)分(fen)析(xi)法(fa)。
2.2 流式細胞儀性能的技術指標
流式細胞儀性能的技術指標主要有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度等。熒光分辨率是指分辨兩個相鄰峰的最小距離，通常用變異係數（CV值）來表示。現在市場上主流型號出廠時的熒光分辨率應該小於2.0%。熒光靈敏度反映了儀器探測最小熒光光強的能力。一般用熒光微球上可測出的FITC的最少分子數來表示。目前儀器均可達到1000左右。儀器工作時樣品濃度一般在105～107細胞/ml。分析速度/分選速度是指流式細胞儀每秒種可分析或分選的顆粒數目。一般分析速度為5000～10000，分選速度控製在1000以下。
流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀(yi)測(ce)量(liang)的(de)數(shu)據(ju)是(shi)相(xiang)對(dui)值(zhi)，因(yin)此(ci)需(xu)要(yao)在(zai)使(shi)用(yong)前(qian)對(dui)係(xi)統(tong)進(jin)行(xing)校(xiao)準(zhun)或(huo)標(biao)定(ding)。流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀(yi)的(de)校(xiao)準(zhun)有(you)二(er)個(ge)目(mu)的(de)，即(ji)儀(yi)器(qi)的(de)準(zhun)直(zhi)調(tiao)整(zheng)和(he)定(ding)量(liang)標(biao)度(du)。通(tong)常(chang)使(shi)用(yong)標(biao)準(zhun)微(wei)球(qiu)作(zuo)為(wei)非(fei)生(sheng)物(wu)學(xue)標(biao)準(zhun)樣(yang)品(pin)，雞(ji)血(xue)紅(hong)細(xi)胞(bao)做(zuo)為(wei)生(sheng)物(wu)學(xue)標(biao)準(zhun)樣(yang)品(pin)。
