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1.1 流式細胞儀的基本概念
流式細胞儀（flow cytonletry，FCM）是對高速直線流動的細胞或生物微粒進行快速定量測定和分析的儀器，主要包括樣品的液流技術、細胞的計數和分選技術，計算機對數據的采集和分析技術等。流式細胞儀以流式細胞術為理論基礎，是流體力學、激光技術、電子工程學、分子免疫學、細胞熒光化學和計算機等學科知識綜合運用的結晶。流式細胞術是一種自動分析和分選細胞或亞細胞的技術。其特點是：測量速度快、被測群體大、可進行多參數測量，即對同一個細胞做有關物理、生物化學特性的多參數測量，且在統計學上有效。
1.2 流式細胞儀的發展簡史
最早的流式細胞儀雛形誕生於1934年，Moldavan提出使懸浮的單個血紅細胞流過玻璃毛細管，在亮視野下用顯微鏡進行計數，並用光電記錄裝置測量的設想。1953年Crosland-Taylor根據牛頓流體在圓形管中流動規律設計了流動室。其後又經過Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不斷改進，設計了光電檢測設備和細胞分選裝置、完成了計算機與流式細胞儀的物理連接及多參數數據的記錄和分析、開創了細胞的免疫熒光染色及檢測技術、推廣流式細胞儀在臨床上的應用。近20年來，隨著流式細胞儀及其檢測技術的日臻完善，人們越來越致力於樣品製備、細胞標記、軟件開發等方麵的工作，以擴大FCM的應用領域和使用效果。
2 流式細胞儀的工作原理和技術指標
2.1 流式細胞儀工作原理
除電源外，流式細胞儀主要由四部分組成：流動室和液流係統：激光源和光學係統；光電管和檢測係統；計算機和分析係統，其中流動室是儀器的核心部件。這四大部件共同完成了信號的產生、轉換和傳輸的任務。
除電源外，流式細胞儀主要由四部分組成：流動室和液流係統：激光源和光學係統；光電管和檢測係統；計算機和分析係統，其中流動室是儀器的核心部件。這四大部件共同完成了信號的產生、轉換和傳輸的任務。
2.1.1 信號的產生、轉換和傳輸
zaiyalizuoyongxia，qiaoyeguanzhongdeqiaoyebeichixubuduandiyaruliudongshi，xingchengyiguwendingdilianxudeyeliu，baozhengleyangbenyewendingdichuyuqiaoyeyeliudezhouxianshang，bingyidangexibaoxingshizhixiantongguojiguangzhaoshequ。jiguangzhaoshequyouchengceliangqu，shizhiyeliuyujiguangshuchuizhixiangjiaodedian。dangxibaoxiedaiyingguangsubiaojiwutongguojiguangzhaoshequshi，chanshengdaibiaoxibaoneibubutongwuzhi、不同波長的熒光信號，這些信號以細胞為中心，向空間360°litijiaofashe，chanshengsansheguangheyingguangxinhao。sansheguangbuyilairenhexibaoyangpindezhibeijishu，yincibeichengweixibaodewulicanshuhuoguyoucanshu。sansheguangyoubaokuoqianxiangjiaosanshehecexiangjiaosanshe。qianxiangjiaosansheyubeicexibaozhijingdepingfangmiqiexiangguan，cexiangjiaosansheguangduixibaomo、胞質、核膜的折射率更敏感，可提供有關細胞內精細結構和顆粒性質的信息。熒光信號也有二種；一(yi)種(zhong)是(shi)細(xi)胞(bao)自(zi)身(shen)在(zai)激(ji)光(guang)照(zhao)射(she)下(xia)發(fa)出(chu)的(de)微(wei)弱(ruo)熒(ying)光(guang)信(xin)號(hao)，另(ling)一(yi)種(zhong)是(shi)經(jing)過(guo)特(te)異(yi)熒(ying)光(guang)素(su)標(biao)記(ji)後(hou)的(de)細(xi)胞(bao)受(shou)激(ji)發(fa)照(zhao)射(she)後(hou)得(de)到(dao)的(de)熒(ying)光(guang)信(xin)號(hao)。在(zai)免(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)中(zhong)常(chang)要(yao)同(tong)時(shi)探(tan)測(ce)兩(liang)種(zhong)以(yi)上(shang)波(bo)長(chang)的(de)熒(ying)光(guang)信(xin)號(hao)，就(jiu)采(cai)用(yong)二(er)向(xiang)色(se)性(xing)反(fan)射(she)鏡(jing)，或(huo)二(er)向(xiang)色(se)性(xing)分(fen)光(guang)器(qi)，來(lai)有(you)效(xiao)地(di)將(jiang)各(ge)種(zhong)熒(ying)光(guang)分(fen)開(kai)。
zaiyalizuoyongxia，qiaoyeguanzhongdeqiaoyebeichixubuduandiyaruliudongshi，xingchengyiguwendingdilianxudeyeliu，baozhengleyangbenyewendingdichuyuqiaoyeyeliudezhouxianshang，bingyidangexibaoxingshizhixiantongguojiguangzhaoshequ。jiguangzhaoshequyouchengceliangqu，shizhiyeliuyujiguangshuchuizhixiangjiaodedian。dangxibaoxiedaiyingguangsubiaojiwutongguojiguangzhaoshequshi，chanshengdaibiaoxibaoneibubutongwuzhi、不同波長的熒光信號，這些信號以細胞為中心，向空間360°litijiaofashe，chanshengsansheguangheyingguangxinhao。sansheguangbuyilairenhexibaoyangpindezhibeijishu，yincibeichengweixibaodewulicanshuhuoguyoucanshu。sansheguangyoubaokuoqianxiangjiaosanshehecexiangjiaosanshe。qianxiangjiaosansheyubeicexibaozhijingdepingfangmiqiexiangguan，cexiangjiaosansheguangduixibaomo、胞質、核膜的折射率更敏感，可提供有關細胞內精細結構和顆粒性質的信息。熒光信號也有二種；一(yi)種(zhong)是(shi)細(xi)胞(bao)自(zi)身(shen)在(zai)激(ji)光(guang)照(zhao)射(she)下(xia)發(fa)出(chu)的(de)微(wei)弱(ruo)熒(ying)光(guang)信(xin)號(hao)，另(ling)一(yi)種(zhong)是(shi)經(jing)過(guo)特(te)異(yi)熒(ying)光(guang)素(su)標(biao)記(ji)後(hou)的(de)細(xi)胞(bao)受(shou)激(ji)發(fa)照(zhao)射(she)後(hou)得(de)到(dao)的(de)熒(ying)光(guang)信(xin)號(hao)。在(zai)免(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)中(zhong)常(chang)要(yao)同(tong)時(shi)探(tan)測(ce)兩(liang)種(zhong)以(yi)上(shang)波(bo)長(chang)的(de)熒(ying)光(guang)信(xin)號(hao)，就(jiu)采(cai)用(yong)二(er)向(xiang)色(se)性(xing)反(fan)射(she)鏡(jing)，或(huo)二(er)向(xiang)色(se)性(xing)分(fen)光(guang)器(qi)，來(lai)有(you)效(xiao)地(di)將(jiang)各(ge)種(zhong)熒(ying)光(guang)分(fen)開(kai)。
經熒光染色的細胞受到適合的光激發後產生的熒光是通過光電轉換器轉變成電信號而進行測量的。最常用的光電轉換器是光電倍增管（PMT）。從PMT輸shu出chu的de電dian信xin號hao需xu要yao經jing過guo放fang大da後hou才cai能neng輸shu入ru分fen析xi儀yi器qi。流liu式shi細xi胞bao儀yi中zhong一yi般ban備bei有you兩liang類lei放fang大da器qi。一yi類lei是shi線xian性xing放fang大da器qi，其qi輸shu出chu信xin號hao與yu輸shu入ru信xin號hao成cheng線xian性xing關guan係xi。線xian性xing放fang大da器qi適shi用yong於yu在zai較jiao小xiao範fan圍wei內nei變bian化hua的de信xin號hao以yi及ji代dai表biao生sheng物wu學xue線xian性xing過guo程cheng的de信xin號hao，如ruDNA測ce量liang等deng。另ling一yi類lei是shi對dui數shu放fang大da器qi，其qi輸shu出chu信xin號hao和he輸shu入ru信xin號hao之zhi間jian成cheng常chang用yong對dui數shu關guan係xi。在zai免mian疫yi學xue測ce量liang中zhong常chang使shi用yong對dui數shu放fang大da器qi。放fang大da後hou的de電dian信xin號hao被bei傳chuan送song到dao計ji算suan機ji，再zai經jing模mo一yi數shu轉zhuan換huan器qi傳chuan輸shu到dao微wei機ji處chu理li器qi形xing成cheng數shu據ju文wen件jian，保bao存cun在zai計ji算suan機ji上shang。保bao存cun在zai計ji算suan機ji上shang的de數shu據ju可ke在zai脫tuo機ji後hou再zai進jin行xing數shu據ju處chu理li和he分fen析xi。
2.1.2 流式細胞儀分選原理
並(bing)不(bu)是(shi)所(suo)有(you)的(de)流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀(yi)都(dou)具(ju)有(you)分(fen)選(xuan)功(gong)能(neng)。流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀(yi)的(de)分(fen)選(xuan)功(gong)能(neng)是(shi)由(you)細(xi)胞(bao)分(fen)選(xuan)器(qi)來(lai)完(wan)成(cheng)的(de)。由(you)噴(pen)嘴(zui)射(she)出(chu)的(de)液(ye)流(liu)柱(zhu)在(zai)電(dian)信(xin)號(hao)作(zuo)用(yong)下(xia)發(fa)生(sheng)振(zhen)動(dong)，斷(duan)裂(lie)形(xing)成(cheng)均(jun)勻(yun)的(de)小(xiao)液(ye)滴(di)。根(gen)據(ju)選(xuan)定(ding)的(de)某(mou)個(ge)參(can)數(shu)由(you)邏(luo)輯(ji)電(dian)路(lu)判(pan)明(ming)是(shi)否(fou)將(jiang)被(bei)分(fen)選(xuan)，而(er)後(hou)由(you)充(chong)電(dian)電(dian)路(lu)對(dui)選(xuan)定(ding)細(xi)胞(bao)液(ye)滴(di)充(chong)電(dian)，帶(dai)電(dian)液(ye)滴(di)攜(xie)帶(dai)細(xi)胞(bao)通(tong)過(guo)靜(jing)電(dian)場(chang)而(er)發(fa)生(sheng)偏(pian)轉(zhuan)，落(luo)入(ru)收(shou)集(ji)器(qi)中(zhong)。使(shi)用(yong)不(bu)同(tong)孔(kong)徑(jing)的(de)噴(pen)孔(kong)及(ji)改(gai)變(bian)液(ye)流(liu)速(su)度(du)，可(ke)能(neng)會(hui)改(gai)變(bian)分(fen)選(xuan)效(xiao)果(guo)。從(cong)參(can)數(shu)測(ce)定(ding)經(jing)邏(luo)輯(ji)選(xuan)擇(ze)再(zai)到(dao)脈(mai)衝(chong)充(chong)電(dian)需(xu)要(yao)一(yi)段(duan)延(yan)遲(chi)時(shi)間(jian)。精(jing)確(que)測(ce)定(ding)延(yan)遲(chi)時(shi)間(jian)是(shi)決(jue)定(ding)分(fen)選(xuan)質(zhi)量(liang)的(de)關(guan)鍵(jian)，可(ke)根(gen)據(ju)具(ju)體(ti)要(yao)求(qiu)進(jin)行(xing)適(shi)當(dang)調(tiao)整(zheng)。
並(bing)不(bu)是(shi)所(suo)有(you)的(de)流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀(yi)都(dou)具(ju)有(you)分(fen)選(xuan)功(gong)能(neng)。流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀(yi)的(de)分(fen)選(xuan)功(gong)能(neng)是(shi)由(you)細(xi)胞(bao)分(fen)選(xuan)器(qi)來(lai)完(wan)成(cheng)的(de)。由(you)噴(pen)嘴(zui)射(she)出(chu)的(de)液(ye)流(liu)柱(zhu)在(zai)電(dian)信(xin)號(hao)作(zuo)用(yong)下(xia)發(fa)生(sheng)振(zhen)動(dong)，斷(duan)裂(lie)形(xing)成(cheng)均(jun)勻(yun)的(de)小(xiao)液(ye)滴(di)。根(gen)據(ju)選(xuan)定(ding)的(de)某(mou)個(ge)參(can)數(shu)由(you)邏(luo)輯(ji)電(dian)路(lu)判(pan)明(ming)是(shi)否(fou)將(jiang)被(bei)分(fen)選(xuan)，而(er)後(hou)由(you)充(chong)電(dian)電(dian)路(lu)對(dui)選(xuan)定(ding)細(xi)胞(bao)液(ye)滴(di)充(chong)電(dian)，帶(dai)電(dian)液(ye)滴(di)攜(xie)帶(dai)細(xi)胞(bao)通(tong)過(guo)靜(jing)電(dian)場(chang)而(er)發(fa)生(sheng)偏(pian)轉(zhuan)，落(luo)入(ru)收(shou)集(ji)器(qi)中(zhong)。使(shi)用(yong)不(bu)同(tong)孔(kong)徑(jing)的(de)噴(pen)孔(kong)及(ji)改(gai)變(bian)液(ye)流(liu)速(su)度(du)，可(ke)能(neng)會(hui)改(gai)變(bian)分(fen)選(xuan)效(xiao)果(guo)。從(cong)參(can)數(shu)測(ce)定(ding)經(jing)邏(luo)輯(ji)選(xuan)擇(ze)再(zai)到(dao)脈(mai)衝(chong)充(chong)電(dian)需(xu)要(yao)一(yi)段(duan)延(yan)遲(chi)時(shi)間(jian)。精(jing)確(que)測(ce)定(ding)延(yan)遲(chi)時(shi)間(jian)是(shi)決(jue)定(ding)分(fen)選(xuan)質(zhi)量(liang)的(de)關(guan)鍵(jian)，可(ke)根(gen)據(ju)具(ju)體(ti)要(yao)求(qiu)進(jin)行(xing)適(shi)當(dang)調(tiao)整(zheng)。
2.1.3 數據的顯示和分析
shujuchulizhuyaobaokuoshujudexianshihefenxi。dancanshuzhifangtushishiyongzuiduodetuxingxianshixingshi，jikeyongyudingxingfenxi，youkeyongyudingliangfenxi。dancanshuzhifangtushiyouX、Y二方向組成的二維平麵圖。橫座標X是所測的熒光或散射光的強度，用“道數”（Channel No．）來表示。選擇的放大器類型不同，標度不同。縱座標Y通tong常chang表biao示shi被bei測ce細xi胞bao的de絕jue對dui數shu目mu。正zheng常chang情qing況kuang下xia，數shu據ju分fen析xi得de到dao的de圖tu形xing為wei具ju有you一yi個ge或huo若ruo幹gan個ge峰feng的de曲qu線xian圖tu。對dui曲qu線xian圖tu的de解jie釋shi應ying該gai具ju體ti問wen題ti具ju體ti分fen析xi。
shujuchulizhuyaobaokuoshujudexianshihefenxi。dancanshuzhifangtushishiyongzuiduodetuxingxianshixingshi，jikeyongyudingxingfenxi，youkeyongyudingliangfenxi。dancanshuzhifangtushiyouX、Y二方向組成的二維平麵圖。橫座標X是所測的熒光或散射光的強度，用“道數”（Channel No．）來表示。選擇的放大器類型不同，標度不同。縱座標Y通tong常chang表biao示shi被bei測ce細xi胞bao的de絕jue對dui數shu目mu。正zheng常chang情qing況kuang下xia，數shu據ju分fen析xi得de到dao的de圖tu形xing為wei具ju有you一yi個ge或huo若ruo幹gan個ge峰feng的de曲qu線xian圖tu。對dui曲qu線xian圖tu的de解jie釋shi應ying該gai具ju體ti問wen題ti具ju體ti分fen析xi。
除直方圖外，數據顯示方式還包括二維點圖、二維等高圖、假jia三san維wei圖tu和he列lie表biao模mo式shi等deng。二er維wei點dian圖tu也ye是shi比bi較jiao常chang用yong的de數shu據ju顯xian示shi類lei型xing。它ta顯xian示shi兩liang個ge獨du立li參can數shu與yu細xi胞bao相xiang對dui數shu之zhi間jian的de關guan係xi，也ye是shi二er維wei平ping麵mian圖tu，橫heng縱zong坐zuo標biao可ke以yi根gen據ju自zi己ji選xuan定ding的de被bei測ce參can數shu自zi行xing決jue定ding，點dian的de位wei置zhi表biao明ming了le細xi胞bao和he顆ke粒li具ju有you的de二er個ge被bei測ce參can數shu的de數shu值zhi。二er維wei點dian圖tu所suo提ti供gong的de信xin息xi量liang要yao大da於yu單dan參can數shu直zhi方fang圖tu。
數shu據ju分fen析xi的de方fang法fa大da體ti可ke分fen為wei參can數shu法fa和he非fei參can數shu法fa兩liang大da類lei。當dang被bei檢jian測ce的de生sheng物wu學xue係xi統tong能neng夠gou用yong某mou種zhong數shu學xue模mo型xing時shi則ze多duo使shi用yong參can數shu方fang法fa。非fei參can數shu分fen析xi法fa不bu用yong對dui顯xian示shi的de圖tu像xiang做zuo任ren何he假jia設she，也ye不bu采cai用yong數shu學xue模mo型xing，分fen析xi程cheng序xu可ke以yi很hen簡jian單dan，也ye可ke能neng很hen複fu雜za。臨lin床chuang醫yi學xue較jiao常chang使shi用yong非fei參can數shu分fen析xi法fa。
2.2 流式細胞儀性能的技術指標
流式細胞儀性能的技術指標主要有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度等。熒光分辨率是指分辨兩個相鄰峰的最小距離，通常用變異係數（CV值）來表示。現在市場上主流型號出廠時的熒光分辨率應該小於2.0%。熒光靈敏度反映了儀器探測最小熒光光強的能力。一般用熒光微球上可測出的FITC的最少分子數來表示。目前儀器均可達到1000左右。儀器工作時樣品濃度一般在105～107細胞/ml。分析速度/分選速度是指流式細胞儀每秒種可分析或分選的顆粒數目。一般分析速度為5000～10000，分選速度控製在1000以下。
流式細胞儀性能的技術指標主要有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度等。熒光分辨率是指分辨兩個相鄰峰的最小距離，通常用變異係數（CV值）來表示。現在市場上主流型號出廠時的熒光分辨率應該小於2.0%。熒光靈敏度反映了儀器探測最小熒光光強的能力。一般用熒光微球上可測出的FITC的最少分子數來表示。目前儀器均可達到1000左右。儀器工作時樣品濃度一般在105～107細胞/ml。分析速度/分選速度是指流式細胞儀每秒種可分析或分選的顆粒數目。一般分析速度為5000～10000，分選速度控製在1000以下。
流liu式shi細xi胞bao儀yi測ce量liang的de數shu據ju是shi相xiang對dui值zhi，因yin此ci需xu要yao在zai使shi用yong前qian對dui係xi統tong進jin行xing校xiao準zhun或huo標biao定ding。流liu式shi細xi胞bao儀yi的de校xiao準zhun有you二er個ge目mu的de，即ji儀yi器qi的de準zhun直zhi調tiao整zheng和he定ding量liang標biao度du。通tong常chang使shi用yong標biao準zhun微wei球qiu作zuo為wei非fei生sheng物wu學xue標biao準zhun樣yang品pin，雞ji血xue紅hong細xi胞bao做zuo為wei生sheng物wu學xue標biao準zhun樣yang品pin。
