注意DNA酶汙染的儀器可能會降解DNA,造成條帶信號弱、模糊甚至缺失的現象。
2.電泳方法
一般的核酸檢測隻需要瓊脂糖凝膠電泳就可以;如果需要分辨率高的電泳,特別是隻有幾個bp的差別應該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳;用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應該使用脈衝凝膠電泳。注意巨大的DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導致缺帶。
3.凝膠濃度
對於瓊脂糖凝膠電泳,濃度通常在0.5~2%之(zhi)間(jian),低(di)濃(nong)度(du)的(de)用(yong)來(lai)進(jin)行(xing)大(da)片(pian)段(duan)核(he)酸(suan)的(de)電(dian)泳(yong),高(gao)濃(nong)度(du)的(de)用(yong)來(lai)進(jin)行(xing)小(xiao)片(pian)段(duan)分(fen)析(xi)。低(di)濃(nong)度(du)膠(jiao)易(yi)碎(sui),小(xiao)心(xin)操(cao)作(zuo)和(he)使(shi)用(yong)質(zhi)量(liang)好(hao)的(de)瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)是(shi)解(jie)決(jue)辦(ban)法(fa)。注(zhu)意(yi)高(gao)濃(nong)度(du)的(de)膠(jiao)可(ke)能(neng)使(shi)分(fen)子(zi)大(da)小(xiao)相(xiang)近(jin)的(de)DNA帶不易分辨,造成條帶缺失現象。
4.緩衝液
常用的緩衝液有TAE和TBE,而TBE比TAE有著更好的緩衝能力。電泳時使用新製的緩衝液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩衝液多次使用後,離子強度降低,pH值上升,緩衝性能下降,可能使DNA電泳產生條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。
5.電壓和溫度
電泳時電場強度不應該超過20V/cm,電泳溫度應該低於30℃,對於巨大的DNA電泳,溫度應該低於15℃。注意如果電泳時電壓和溫度過高,可能導致出現條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。特別是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現缺帶現象
6.DNA樣品的純度和狀態
zhuyiyangpinzhonghanyanliangtaigaohehanzazhidanbaijunkeyichanshengtiaodaimohuhetiaodaiqueshidexianxiang。yichunchendiankeyiquchuduoyudeyan,yongfenkeyiquchudanbai。zhuyibianxingdeDNA樣品可能導致條帶模糊和缺失,也可能出現不規則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對DNA樣品加熱,用20mM NaCl緩衝液稀釋可以防止DNA變性。
7.DNA的上樣
正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導致DNA帶型模糊,而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚至缺失。
8.Marker的選擇
DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對照DNA來估計DNA pian段大小。Marker應該選擇在目標片段大小附近ladder較密的,這樣對目標片段大小的估計才比較準確。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標準。如果選擇λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker,需要預先65℃加熱5min,冰上冷卻後使用。從而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導致的片段連接不規則或條帶信號弱等現象。
9.凝膠的染色和觀察
實驗室常用的核酸染色劑是溴化乙錠(EB),ransexiaoguohao,caozuofangbian,danshiwendingxingcha,juyouduxing。zhuyiguanchaningjiaoshiyinggenjuranliaobutongshiyongheshideguangyuanhejifabochang,ruguojifabochangbudui,tiaodaizebuyiguancha,chuxiantiaodaimohudexianxiang。
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