DNA序列測定是分子生物學領域最重要的技術之一，是了解基因結構和功能的基礎。DNA測序技術的不斷完善和儀器自動化程度的不斷提高
，為大型基因組測序奠定了基礎
，當今大多數蛋白質序列都是通過基因或cDNA的核苷酸序列推導出來的。DNA測序方法主要有雙脫氧鏈終止法（Sanger法）和化學降解法（Maxam-Gilbert法）。目前不管是傳統的手工測序法，還是儀器自動測序法均使用前者，而儀器自動測序法以其快速
、準確等優點得以廣泛應用。我室於1995年，引進美國PE公司的373A型DNA序列測定儀
，儀器專管共用，兩年來為校內
、外科研人員提供測序服務，現將該儀器使用中的一點體會報告如下。

1
、測序原理和特點

373A型DNA測序儀使用雙脫氧鏈終止法（Dye-primer或Dye-terminator）進行DNA測序反應，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，實時檢測自動讀序。該儀器與其它儀器相比較，其顯著特點是它能用4種不同的熒光分子分別標記4種反應引物（Dye-primer法）或4種dNTP（Dye-terminator法）。4個反應分開進行，產物合並在一個泳道中電泳分離，根據每條區帶的熒光不同加以識別讀序，這樣不但可提高每次分析樣品的數量（373A型每次可測定36個樣品），又克服了泳道間差異造成的讀序誤差。與傳統的手工測序比較：①安全，無汙染
；用熒光素代替同位素，避免了放射性同位素的汙染和對人體的危害；②模板用量大大減小，單鏈DNA模板用量為0.4μg，雙鏈DNA質粒模板用量為0.8μg，PCR產物用量為5ng～20ng；③測序長度大大提高，一般可達450bp～500bp。

2、體會

2.1　模板純化是前提　DNA測序所用的模板可以是質粒DNA
，也可以是PCR產物
，但使用高質量的模板是測序成功的前提。DNA純化的方法很多，如聚乙二醇沉澱法、瓊脂糖凝膠電泳法
、氯化銫梯度離心法、高效液相色譜法（HPLC法）和一次性微柱法等。用這些方法純化的DNA都可用於DNA測序
，但從我們實驗結果來看，HPLC法和微柱法（如Promega公司的Wizard Plus Miniprep DNA Purification System）效果最好。為了保證測序的成功率
，測序模板純化後
，必須先進行1%瓊脂糖凝膠電泳（凝膠中含0.5mg/L溴化乙錠
，樣品濃度為0.2g/L，上樣量為1μl）鑒定其純度，要求條帶清晰，無雜帶，無拖尾
，否則應重新純化，以保證測序的結果。

2.2　測序反應是關鍵　測序反應是DNA自動測序的第一步，也是測序成敗的關鍵所在。符合測序要求的DNA模板，經過測序反應後,會形成數百條帶有不同熒光的核苷酸鏈，且每條核苷酸鏈的堿基數隻相差1個堿基。目前，我們使用的測序試劑為PE公司提供的DNA測序試劑盒（Dye-primer或Dye-ter-minator），其中每種試劑的濃度為產品的最佳組合
，而且測序反應的條件（變性、退火
、延伸的時間和溫度）與試劑盒配套使用。這就必須按照試劑盒的要求控製好模板的濃度，即使純度合格的DNA模板其濃度也很重要，單鏈DNA模板為0.10g/L，雙鏈質粒模板為0.20g/L，PCR產(chan)物(wu)根(gen)據(ju)其(qi)片(pian)段(duan)的(de)長(chang)度(du)取(qu)適(shi)當(dang)的(de)量(liang)，濃(nong)度(du)過(guo)高(gao)或(huo)過(guo)低(di)都(dou)會(hui)直(zhi)接(jie)影(ying)響(xiang)測(ce)序(xu)的(de)結(jie)果(guo)。根(gen)據(ju)我(wo)們(men)的(de)使(shi)用(yong)情(qing)況(kuang)，濃(nong)度(du)太(tai)高(gao)時(shi)，電(dian)泳(yong)條(tiao)帶(dai)信(xin)號(hao)強(qiang)，會(hui)出(chu)現(xian)平(ping)頭(tou)峰(feng)，測(ce)序(xu)結(jie)果(guo)短(duan)（一般＜250bp），而且誤差大；濃度過低時，電泳條帶信號弱
，噪聲多
，誤差大，可信度差。在使用Dye-termina-tor法測序時（一般模板為PCR產物），除模板的純度和濃度符合要求外，所用引物的純度和濃度也很重要，引物應為測序級純度，濃度應準確定量。

2.3　電泳條件是保證　前麵已提到
，測序反應產物經電泳分離後,實時進行自動讀序，要使隻差1個堿基的DNA鏈達到最佳分離
，電泳的條件至關重要。373A型DNA測序儀使用的是尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度為4.75%
，恒功率（30W）
，zhexietiaojianxiangduiguding
，suoyidianyongdechengbaizhuyaoqujueyuningjiaodepeizhi。yishidianyongshijidechundu。youyugaixitongshijianceyingguangxinhao，suoyiyaoqiushijibunenghanyouzazhi
，womenshiyongSigmagongsideshijihebufenguochanfenxichunshiji
，jingshiyanzhengshikeyidadaoshiyandeyaoqiu。ershiningjiaopeizhi。yaoqiugezhongshijidechengliangyaozhunque，chuningjiaonongduzhunquewai，TBE緩衝液的配製尤為重要
，否則會影響電泳結果，造成測序失敗，這是由於TBE的離子濃度的高低可直接引起電泳時電壓的升高或降低。三是灌膠要仔細。要防止產生氣泡、波浪紋等而影響電泳分離。

總之
，在使用全自動DNA測序儀時
，模板的純度和濃度、測序反應
、電泳分離等環節都會影響測序的結果，任何一個環節出現問題，都會造成前功盡棄。根據我們的經驗
，在測序試劑盒質量有保證、儀器工作正常
、實shi驗yan人ren員yuan精jing心xin操cao作zuo的de前qian提ti下xia
，測ce序xu模mo板ban的de純chun度du和he濃nong度du是shi測ce序xu成cheng功gong的de關guan鍵jian，測ce序xu失shi敗bai往wang往wang是shi由you於yu模mo板ban的de純chun度du不bu夠gou或huo濃nong度du不bu準zhun所suo致zhi。兩liang年nian來lai中zhong我wo們men測ce定ding了le數shu百bai份fen樣yang品pin，成cheng功gong率lv達da到dao88%。其中Dye-primer法測定的樣品占95%
，單鏈DNA模板單向測序可達700bp～800bp
，雙鏈質粒模板單向測序可達500bp～600bp。