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1.CT值比較靠後，對實驗有一定的影響，因為經過那麼多次的循環，酶的活性有可能有所下降，這時候擴增效率會有所改變（而定量 PCR 的理論基礎就是每次循環的擴增效率我們認為是確定的一個值）。因此最好能夠把CT 值往前移。
解決辦法可以將模板加以濃縮或者抽幹之後用少量水去溶解。
2. 為什麼合成的引物做不加摸板的對照也能擴增出目的條帶，而內參用同樣體係就沒有呢?
引物被汙染。
3. 實時定量 PCR，熒光定量 PCR，實時熒光定量 PCR，real－time PCR，這些是不是同一個概念？
是一個概念。
4. 我的標準曲線的 slope 總是大於４，而且每個梯度的平行 ct 值差別比較大，原因？
這個斜率是＝1/LOG 10(擴增效率)，理論上擴增效率＝2，斜率是 3.322。如果斜率大於 4，說明擴增效率比較小。可以考查一下反應體係是否合理？酶活是否正常？
平行管的 CT 值差別大可以考查一下自己實驗操作是否規範，另外一種原因就是儀器本身的誤差也可能會導致 CT 值差別比較大。
當斜率為 4 的時候，擴增效率是 77.8%，斜率大於 4 的話，效率繼續下降。
擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率(lv)的(de)問(wen)題(ti)實(shi)際(ji)就(jiu)是(shi)引(yin)物(wu)的(de)擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率(lv)，可(ke)能(neng)酶(mei)活(huo)的(de)關(guan)係(xi)沒(mei)有(you)那(na)麼(me)重(zhong)要(yao)，前(qian)提(ti)是(shi)試(shi)劑(ji)盒(he)的(de)質(zhi)量(liang)有(you)保(bao)證(zheng)。回(hui)到(dao)擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率(lv)，隻(zhi)有(you)在(zai)引(yin)物(wu)和(he)模(mo)板(ban)處(chu)於(yu)最(zui)適(shi)比(bi)例(li)時(shi)才(cai)能(neng)得(de)到(dao)比(bi)較(jiao)滿(man)意(yi)的(de)擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率(lv)，因(yin)此(ci)通(tong)過(guo)調(tiao)節(jie) PCR 反應體係中的引物終濃度來解決，可以做一些引物梯度來比較。
5. ROX 染料是什麼作用？
ROX 的作用 ABI 宣稱是用來校準加樣誤差的。但是據說 ROX 的作用實際上是用來校準光程差的。即每個孔的熒光信號經過濾光片在經過聚焦到CCD的時候，走過的光程是不一樣的，這樣在 CCD 上成像的亮度就不一樣了。所以需要把這個差異用 ROX 來計算孔間差異有多大，然後差異係數去處理，實際的熒光信號。
6. 熒光定量PCR的基線，是怎麼確定的呢？
基線就是背景值，因此就是曲線在沒有“起跳”之前的一段。在軟件上有一個地方可以輸入 baseline 從第幾到第幾 cycle 作為基線。設置原則是使沒有起跳之前最多的 cycle 的信號接近0.
7. 熔解曲線出現多峰 (較為理想的熔解曲線是單峰曲線)
非特異性擴增
引物設計不夠優化：根據設計原則設計新引物。可通過梯度 PCR 對引物退火溫度進行優化;
出現引物二聚體引物設計不合理而導致的引物二聚體在熔解曲線內峰值一般位於 75℃左右，如該峰顯著請按照以下方麵進行優化：
A.優化擴增條件，如提高退火溫度，可利用梯度 PCR，摸索最佳的 Tm 值。通常兩步循環(由 95℃變性步驟直接進入 60℃退火和延伸步驟) 有利於強效擴增，因此引物設計時設定的成功退火溫度為 60°C。
B.引物濃度太高，適當降低引物濃度。通常引物的 Tm 低於目的基因，熔解曲線上峰值在目的基因峰的左邊。大多數情況下，每條引物的理想最終濃度為 200 nM，但如有需要，可將濃度降至 60 nM。
C.可通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶，通常位於 100 bp 以下。在 PCR 過guo程cheng中zhong，二er聚ju體ti的de形xing成cheng與yu模mo板ban的de退tui火huo及ji延yan伸shen之zhi間jian存cun在zai競jing爭zheng作zuo用yong。引yin物wu二er聚ju體ti通tong常chang隨sui模mo板ban的de減jian少shao而er增zeng加jia。單dan獨du采cai用yong凝ning膠jiao電dian泳yong分fen析xi進jin行xing驗yan證zheng的de缺que點dian在zai於yu，其qi靈ling敏min度du最zui低di僅jin達da到dao納na克ke級ji，因yin此ci可ke能neng無wu法fa得de出chu結jie果guo。凝ning膠jiao電dian泳yong分fen析xi的de優you勢shi是shi當dang解jie離li曲qu線xian(熔解曲線) 數據同時可用時，產物的大小有助於對結果進行綜合解釋;cDNA 模板帶有基因組汙染：重新製備 cDNA 模板。
8. 擴增曲線形狀異常，如“S”型曲線
• 反應體係引起的擴增曲線不光滑---擴增效率偏差（過高或過低）
A. 擴增效率過高
出現非特異擴增或引物二聚體：反應體係內模板濃度太高以及模板核酸質量較差（例如，如果采用矽膠柱純化時，結合 DNA 或 RNA 的離液鹽可抑製 Taq DNA 聚合酶。如果采用有機萃取法，則苯酚和乙醇殘餘物也具有相同的效應），可能導致出現抑製 PCR 反應的現象。在絕對定量時表現擴增效率大於 110%。
解決方案：
1）去除模板濃度最高的反應孔並重新分析標準曲線。如果效率重新回到 110% 以下，則分析良好；
2）對目的基因做標準曲線，一般用克隆的該基因的質粒做梯度稀釋，或用 PCR 產物做梯度稀釋，然後做定量擴增，通過曲線評估反應效率。絕對定量有效的擴增效率在 90%-110%;
3）重(zhong)新(xin)純(chun)化(hua)模(mo)板(ban)，去(qu)除(chu)模(mo)板(ban)中(zhong)存(cun)在(zai)的(de)潛(qian)在(zai)抑(yi)製(zhi)物(wu)。切(qie)記(ji)應(ying)延(yan)長(chang)幹(gan)燥(zao)時(shi)間(jian)，以(yi)去(qu)除(chu)乙(yi)醇(chun)沉(chen)澱(dian)過(guo)程(cheng)中(zhong)的(de)乙(yi)醇(chun)，或(huo)采(cai)用(yong)另(ling)外(wai)的(de)純(chun)化(hua)柱(zhu)加(jia)入(ru)洗(xi)滌(di)液(ye)將(jiang)離(li)液(ye)鹽(yan)從(cong)矽(gui)膠(jiao)純(chun)化(hua)物(wu)中(zhong)去(qu)除(chu)。
B. 擴增效率過低
擴增效率過低主要表現在試劑濃度不適（主要是引物、鎂和 Taq DNA 聚合酶，尤其是在多重實驗中），引物對 Tm 之間的差異超過 5°C 以及熱循環條件不適，試管中各種同源物質的競爭作用可造成反應效率低下。絕對定量表現：擴增效率＜90%。解決方案：對上述因素逐一排除後進行調整優化實驗體係。
C. 個別擴增曲線異常
如個別擴增曲線突然驟降：反fan應ying管guan內nei留liu有you氣qi泡pao，由you於yu溫wen度du升sheng高gao後hou氣qi泡pao破po裂lie，使shi儀yi器qi檢jian測ce到dao的de熒ying光guang值zhi突tu然ran降jiang低di所suo致zhi。進jin行xing擴kuo增zeng反fan應ying之zhi前qian要yao仔zai細xi檢jian查zha反fan應ying管guan內nei是shi否fou有you氣qi泡pao殘can留liu
1）儀器設置不當引起的曲線異常
基線設置不當，如擴增曲線斷裂或下滑：基線的終點值大於 Ct 值。減小基線終點 (Ct值- 4)，重新分析數據; jixianfanweiheyuzhishezhibudang。jixianfanweiheyuzhidoushirenweishedingdecanshu。erzheyibanyouyiqizidongmorenweiheshizhi。zaiduitongyichengxuzhongdeduozhongshijihehuohuaxuejijinxingpinggushi，jingchangchuxianyuzhishezhibudangzaochengbutongzubieshujudekuozengquxianchayi：軟件自動選擇的閾值更適合平台更高的曲線 (下圖中的藍色曲線)，這將導致此數據組中的紅色曲線的 Ct 值出現偏差，因為其最佳閾值比此值更低。因此，需對每個數據組進行獨立研究，這樣才能根據具體情形選擇最佳閾值;
2）Rox 添加不當
表現為擴增曲線呈鋸齒狀且不連續，需校正參比染料。
9. Ct 值出現太晚
• 擴增效率極低：優化反應條件，嚐試三步法擴增程序，或者重新設計引物;
• 模板濃度太低：減少稀釋度重複實驗;
• 模板降解：重新製備模板，重複實驗;
• PCR 產物太長：一般將PCR產物長度設計為 100 bp-150 bp之內;反應體係中存在PCR 反應抑製劑：一般為加入模板時帶入，模板質量不高，加大模板稀釋倍數或者重新製備模板重複實驗。
10. 陰性對照也出現明顯擴增
• 反應體係組分（如，水）被汙染：實驗過程中，更換新的 Mix 或者水重複實驗;
• 標本間的交叉汙染或產物汙染：反應體係在超淨工作台內配製，對實驗室進行嚴格的區分，減少氣溶膠汙染；使用帶濾芯的槍頭;
• 引物二聚體的出現：一般在 35 循環以後陰性對照出現擴增屬正常情況，可配合熔解曲線，PCR 產物的瓊脂糖電泳結果進行分析。
11. 絕對定量時標準曲線線性關係不佳
• 加樣誤差：加大模板稀釋倍數，提高加樣體積;
• 標準品降解：重新製備標準品，重複實驗;
• 模板濃度太高：增加模板稀釋倍數。
12. 反應結束無擴增曲線出現
• 擴增效率問題：電泳檢測 qPCR 反應產物，觀察是否有目的條帶的出現。如果沒有，則需要逐一排查引物、模板以及反應條件問題;
• 確認引物是否降解：長時間未用的引物應先通過 PAGE 電泳檢測完整性，以排除引物降解的可能性;
• 模板濃度太低或目標基因表達豐度過低：減少稀釋度重複實驗，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。另外通常基因表達檢測所需的 cDNA 量為 1 到 100ng。但(dan)是(shi)如(ru)果(guo)樣(yang)本(ben)中(zhong)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)的(de)豐(feng)富(fu)很(hen)低(di)，可(ke)能(neng)就(jiu)需(xu)要(yao)更(geng)多(duo)的(de)樣(yang)本(ben)量(liang)。檢(jian)測(ce)一(yi)個(ge)樣(yang)本(ben)量(liang)的(de)範(fan)圍(wei)，或(huo)者(zhe)更(geng)理(li)想(xiang)的(de)情(qing)況(kuang)下(xia)加(jia)入(ru)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)反(fan)應(ying)確(que)認(ren)反(fan)應(ying)本(ben)身(shen)正(zheng)常(chang)。如(ru)果(guo)對(dui)期(qi)望(wang)的(de)表(biao)達(da)水(shui)平(ping)不(bu)是(shi)很(hen)確(que)定(ding)，可(ke)重(zhong)新(xin)查(zha)詢(xun)文(wen)獻(xian)或(huo) NCBI U
• 模板降解：重新製備模板，重複實驗;
• 逆轉錄問題：與低表達量相關，如果目的基因在樣本中的豐度很低，需要增加實驗的靈敏度。確認一下qPCR 反應中沒有加入過量的 cDNA (最大加樣水平為 20% v/v)，因為過量的 cDNA 樣本會引入抑製劑降低反應效率。也可以檢查一下逆轉錄酶和引物。隨機引物通常比基於 oligo(dT) 的方法產生更多的 cDNA。另外，有些逆轉錄酶經過熱穩定性改造，也會提高 cDNA 產量。檢查反應中的各組分，通過優化各組分提高擴增效率;確認是否是程序設置不當：
• 如是否設置了信號采集步驟：兩部法擴增程序一般將信號采集設置在退火延伸階段；三步法擴增程序應當將信號采集設置在 72℃延伸階段;
• 確認了上述因素後排查是否反應循環數不夠：一般設置循環數為 40，但需要注意的是過多的循環會增加過多的背景信號，降低數據可信度;
• 實驗設計問題如果沒有見到任何擴增，還可能是引物/探針的設計並未針對正確的靶點。檢查序列數據庫如 NCBI 搜尋目的基因的不同變異型。有可能實驗設計隻是針對了其中一種變異體，但是在所研究的樣本裏並無表達。同時還要檢查引物/探針靶向的目的基因的區域，是在編碼區還是內含子？靶向 5’UTR 區域是不會檢查到轉染到細胞裏的外源基因表達的 (因為 5’UTR 區域是不會包含在表達載體質粒上的)。類似的情況，如果實驗設計是靶向內含子序列的，也是不會從 cDNA 樣本中得到擴增的;
• 產品儲存是否得到：該產品-20℃保存可以長期保持活性，推薦-20℃保存。4℃保存將會導致產品活性下降。因反複凍融也可能導致產品活性下降，因此當每次用量較小時，推薦小體積分裝後-20℃保存。
13. 實驗重複性差
• 加樣體積失準：使用性能較好的移液槍，擴大反應體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應體係中；定量 PCR 儀不同位置溫度控製不一致：定期校準儀器;
• 模板濃度太低：模板濃度越稀，重複性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積;qPCR mix 沒有完全混勻。請使用前充分混勻, 重複性好的擴增曲線：重複性較理想的擴增曲線 STD＜0.2。
14. 絕對定量中通過以下參數對 qPCR 結果加以判定---線性關係、擴增效率確認
• 相關係數（R2）：＞0.98，越接近 1，結果可信度越高。R＞0.99 或 R2＞0.98；
• 標準曲線斜率：-3— -3.5，100%擴增效率對應的斜率是-3.32；
• PCR 擴增效率（E）：90%-110%，越接近 1，越理想。其對應的斜率為 -3.58 至-3.10。效率= 10(-1/斜率)-1；
• 檢測靈敏度確認：35Cycles 內可得到好的定量結果，如果采用 SYBR 檢測方法，30cycles 內無非特異性產物擴增；
• NO template control （NTC）確認：35cycles 內無引物二聚體產生；重複性:STD＜0.2。
15. 絕對定量和相對定量的差別？
• 絕對定量目的是測定目的基因在樣本中的分子數目，即通常所說的拷貝數:相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數;絕對定量實驗必須使用已知拷貝數的絕對標準品，必須做標準曲線:
• 相對定量可以做標準曲線，也可以不做標準曲線;相對定量實驗有兩種方法：標準曲線法和 Ct zhibijiaofa。ruguoshiyongbiaozhunquxianfa，keyishiyongjueduibiaozhunpin，yekeyishiyongxiangduibiaozhunpin，erqiexiangduibiaozhunpinzaishiyancaozuoshanggengweijianbianyixing。xiangduibiaozhunpinshizhizhidaoyangpinzhongDNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數目的標準品，典型的做法是將一個已知 pg 數的樣品做一係列梯度稀釋。
