yibanlaishuo，ruguoyongduojulaiansuanbaobeiguodepianzizuozhengchangmianyizuzhihuaxueransedehuashibuhuidiaopianzide。danruguoyaozuokangyuanxiufudehua，ruguopianzichulibuhaodehuashiyoukenengdiaopianzide。nikeyishishiyixiadefangfa：

1.一般用APES：丙酮=1:50的處理液來處理片子，處理5min左右，然後水洗，烘幹既可用於貼片。如果把水滴再處理好的片子上

，水比較聚的話說明片子處理的好。

2.貼片子的時候
，展片的時間要把握好，不要太長
，否則不利於貼牢。

3.烤片子也很重要
，切好的片子最好先不要馬上收起來，而是水平至於烘片台上37度兩個小時以上，一是水分徹底烘幹。然後做染色前最好再在60度烘箱烘1個小時。

4.再補充一點 ，石蠟包埋時，酒精梯度脫水以及浸蠟等一點要充分
，這對貼片也有影響。

如果這些導致掉片的因素都已經排除但是片子還是掉的厲害，那麼也可能是以下原因造成的：

1、多(duo)聚(ju)賴(lai)氨(an)酸(suan)玻(bo)片(pian)質(zhi)量(liang)的(de)問(wen)題(ti)。我(wo)原(yuan)先(xian)是(shi)買(mai)的(de)
，邁(mai)新(xin)按(an)說(shuo)也(ye)是(shi)不(bu)錯(cuo)的(de)



，可(ke)是(shi)都(dou)脫(tuo)成(cheng)什(shen)麼(me)樣(yang)子(zi)了(le)。後(hou)麵(mian)補(bu)做(zuo)第(di)二(er)批(pi)時(shi)用(yong)的(de)病(bing)理(li)科(ke)老(lao)師(shi)自(zi)己(ji)做(zuo)的(de)片(pian)子(zi)
，要(yao)好(hao)一(yi)點(dian)。

2、組織切的不好
，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻
，或者切片者手法不好等。

3、組織的問題，我用的組織癌症的很多，越是癌症組織有壞死之類越容易脫。

4
、沒烤好，時間短溫度不夠之類。

5
、操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛生紙從邊緣上慢慢吸水。

6、修複的問題：抗原修複的時候高壓時間過長了，或者放進100度的修複液時手法不好，咚的一聲就丟進去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修複比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，隻有從另外的問題上著手。

       此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用PBS的時候盡量用泡的，不要衝。基本上把這些方麵都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。

二. DAB顯色後發現切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？

       著色不均勻可能與你的實驗手法有很大關係，可能原因有：

1.切出的片子厚度本身可能就不一樣
，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一。

2.有可能是你 顯xian色se液ye底di物wu加jia到dao片pian子zi上shang後hou沒mei有you搖yao勻yun，造zao成cheng局ju部bu底di物wu濃nong度du不bu一yi致zhi
，所suo以yi加jia完wan顯xian色se液ye後hou最zui好hao將jiang片pian子zi來lai回hui左zuo右you晃huang動dong幾ji下xia，使shi片pian子zi上shang所suo有you區qu域yu的de底di物wu濃nong度du一yi致zhi。

3.如(ru)果(guo)你(ni)的(de)片(pian)子(zi)是(shi)中(zhong)間(jian)的(de)染(ran)色(se)深(shen)，靠(kao)近(jin)邊(bian)上(shang)的(de)淺(qian)，那(na)有(you)可(ke)能(neng)是(shi)你(ni)蠟(la)圈(quan)畫(hua)的(de)太(tai)小(xiao)
，顯(xian)色(se)液(ye)覆(fu)蓋(gai)的(de)麵(mian)積(ji)不(bu)過(guo)大(da)而(er)產(chan)生(sheng)了(le)邊(bian)緣(yuan)效(xiao)應(ying)。最(zui)外(wai)側(ce)的(de)組(zu)織(zhi)片(pian)最(zui)好(hao)離(li)顯(xian)色(se)液(ye)外(wai)緣(yuan)0.5cm。

三. 切片染色後背景太深，不易區分特異性與非特異性著色？

a.也許是抗體本身有問題，因為有很多公司的抗體質量並不好
，很容易上背景，可以換一種抗體 試試。

b.如果經費不允許換抗體的話，你可降低抗體的濃度，並隨時注意觀察顯色
，在能看到信號的情況下盡量降低背景。

c.可以換一種封閉液，不同的封閉液對某種來源的抗體來說，會有不同的封閉效果。

d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所檢測動物組織的正常血清，這樣可以去除一部分非特異性染色。

全片著色

       全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現這種現象的原因有：

（1）抗體濃度過高：yikangnongduguogaoshichangjiandeyuanyinzhiyi。jiejuebanfashi
，meicishiyongxinkangtiqianyingdangduiqigongzuonongdujinxingceshi
，shimeiyikangtigetihua，zhaodaoshihezijishiyanshidelixianggongzuonongdu，jishishijiyongxingdekangtiyeyingruci，bunengzhijiandandeanshuomingshujinxingranse。

（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是
，嚴格執行操作規程，最好隨身佩帶報時表或報時鍾，及時提醒

，避免因遺忘而造成時間延長。現在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統的1小時
，而是30分鍾，因此
，要根據染色結果進行調整。

（3）DAB變質和顯色時間太長：DAB最好現用現配，如有沉渣應進行過濾後再用。配製好的DAB不應存放時間太長

，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會 遊離出 氧原子與DAB產生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱裏幾天後再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監控，達到 理li想xiang的de染ran色se程cheng度du時shi立li即ji終zhong止zhi反fan應ying。不bu過guo當dang染ran色se片pian太tai多duo時shi或huo用yong染ran色se機ji時shi，這zhe樣yang做zuo似si乎hu不bu現xian實shi，但dan至zhi少shao應ying對dui一yi些xie新xin的de或huo少shao用yong的de抗kang體ti顯xian色se時shi進jin行xing監jian控kong，避bi免mian顯xian色se時shi間jian過guo長chang。

（4）組織變幹：修複液溢出後未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變幹的原因。解決的辦法是操作要認真仔細
，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

（5）切片在緩衝液或修複液中浸泡時間太長（大於24小時）：原因上不清楚，但現象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修複，第二天加抗體進行免疫組 化染 色，如果將裝有切片和修複液的容器放在4?C冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天
，會出現背景著色

，因此，不可存放時間太 長。

（6）一抗變質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麽不顯色要麽背景著色。用新買的抗體時最好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。

四. 免疫組化結果老是出現陰性結果？

      免mian疫yi組zu化hua出chu現xian陰yin性xing結jie果guo有you可ke能neng組zu織zhi本ben身shen就jiu沒mei有you信xin號hao，也ye有you可ke能neng是shi抗kang體ti出chu了le問wen題ti。可ke以yi找zhao一yi些xie陽yang性xing組zu織zhi做zuo一yi下xia，以yi確que定ding是shi抗kang體ti的de問wen題ti還hai是shi組zu織zhi本ben身shen就jiu沒mei有you所suo檢jian測ce的de抗kang原yuan表biao達da。還hai有you，可ke以yi提ti高gao抗kang體ti的de濃nong度du，或huo者zhe試shi一yi試shi抗kang原yuan修xiu複fu等deng方fang法fa，也ye許xu會hui得de到dao意yi想xiang不bu到dao的de結jie果guo。

五. 一抗從4度拿出後
，為什麼有人說要37度複溫，目的是什麼
？

1. 一方麵，防止切片從4度直接放入PBS易脫片
；

2. 另一方麵，使抗原抗體結合更穩定。一般不需要,但對表達較弱的抗原可能有用,4度和37度時分子運動方式不同,前者分子碰撞機率和運動速度小於後者,後者結合更快,但敏感性也提高了並易造成非特異染色。

六. 免疫組化中抗原修複的最佳條件是什麼
？尤其是微波修複。

       關於抗原修複，我個人的觀點和panther75有點不同。我試過的修複條件有EDTA熱修複，檸檬酸鈉為緩衝液的微波修複以及高壓鍋修複。從我的實驗結果 來看，微波修複其實很不容易掉片子的

，而EDTA熱修複和高壓鍋修複是很容易掉片子的。因為掉片子主要是因為加熱過程中產生的氣泡所引起，而微波修複水加 熱到沸騰

，沾在片子上的氣泡就會少

，不會因為小氣泡上串引起脫片。做EDTA修複時，你可以將片子靠的盡量近些，或是在載玻片四周墊些棉花什麼的，然後蓋 上蓋玻片，這樣修複的話就能夠盡量減少載玻片上小氣泡的形成。

       我們用的微波修複條件為：

       2.94g檸檬酸三鈉溶於1000ml的水
，調ph值至6.0，微波修複10分鍾。你可以試試
，時間可以根據需要自己調整。

七. 有人在一抗孵育前用tritonX100來通透細胞，對石蠟切片需要否？

       yongshilaqiepianzuomianyizuhuashibuxuyaotoumochulide
，yishiyinweishilaqiepianbijiaobo，lingwaiyigeyuanyinworenweishizaibaomaiguochengzhongxibaomoyijingbeipohuai

，suoyizheyibukeyishenglve。

八. 蘇木素複染的時間應該是多少
？複染過度咋辦？

       複染時間不需要太長
，當然這也要根據蘇木精的質量來確定，但基本上不要超多一分鍾。染色過深的話可以用酸性的水溶液（在水裏滴加少量濃鹽酸）分色
，分色的另 外(wai)一(yi)個(ge)目(mu)的(de)是(shi)洗(xi)掉(diao)蘇(su)木(mu)精(jing)在(zai)細(xi)胞(bao)質(zhi)中(zhong)的(de)非(fei)特(te)異(yi)性(xing)結(jie)合(he)，這(zhe)樣(yang)可(ke)以(yi)使(shi)細(xi)胞(bao)質(zhi)中(zhong)的(de)特(te)異(yi)信(xin)號(hao)更(geng)明(ming)顯(xian)。所(suo)以(yi)不(bu)管(guan)複(fu)染(ran)是(shi)不(bu)是(shi)過(guo)度(du)，分(fen)色(se)這(zhe)一(yi)步(bu)最(zui)好(hao)不(bu)要(yao)省(sheng)掉(diao)。分(fen)色(se)後(hou)記(ji)得(de)再(zai) 用氨水返藍一下。