一、無色片

 

      染色結束後
，切片中見不到任何陽性信號。這是常規工作中比較常見的現象，出現這種現象，有兩種可能：1、真陰性結果：整個染色過程沒有出現問題
，組織或細胞確實不表達與抗體相關的抗原。2、假陰性結果：即此陰性結果不是真實的反映。假陰性結果又可分為兩種情況：（1）qiepianzhonggenbenjiububaohansuoyuqijianzhadezuzhihuoxibao。chuxianzhezhongqingkuang，yaomeshibingliyishengxuanzecuoleqiepianhuokangtixuancuole
，yaomeshijishuyuanxuancuolelakuai。huodezhengquedeqiepianjinxingranseshihuodezhengquejieguodeqianti。youcibiaoming：製作出合格的免疫組化切片不僅僅是技術員的事
，病理醫生也起著不可缺少的作用。（2）染色過程中的某一或某些環節出了問題。比如，組織未進行抗原修複，有的組織必須經過抗原修複才能檢測抗原表達
；或選用了隻能用於冰凍組織而不能用於石蠟包埋組織的抗體；或一抗失效

，雖然抗體失效在理論上是一個逐漸的過，但偶爾也遇到突然失效的情況
，抗體長期不用和/或已超過有效期是主要的原因。也可見於染色過程中漏掉了某一環節，如忘記加二抗或三抗，或用了兩次二抗而缺少了三抗
，或配製DAB時少了過氧化氫。為了避免這種簡單的錯誤，有一種簡單的方法：在三抗孵育結束時
，將切片上的三抗甩在一張白紙上，在將配製好的DAB滴一滴在白紙的三抗上，觀察是否出現棕色。如果出現了
，證明三抗和DAB的配製過程沒有錯誤。如果這種DAB再滴到切片上沒有出現任何陽性信號，問題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現棕色反應，問題肯定在三抗或DAB的配製過程。這種簡單方法能迅速的幫助我們查找出現問題可能的原因。

 

      解決陰性染色的問題非常簡單
，就是設立“陽性對照”。如ru果guo陽yang性xing對dui照zhao有you了le表biao達da，說shuo明ming染ran色se的de全quan過guo程cheng和he所suo有you試shi劑ji都dou沒mei有you問wen題ti。如ru果guo此ci時shi測ce試shi片pian仍reng為wei陰yin性xing，便bian是shi真zhen實shi的de陰yin性xing
，說shuo明ming組zu織zhi或huo細xi胞bao沒mei有you相xiang應ying的de抗kang原yuan表biao達da。反fan之zhi，如ru果guo陽yang性xing對dui照zhao沒mei有you著zhe色se
，表biao明ming染ran色se過guo程cheng中zhong某mou個ge或huo某mou些xie步bu驟zhou出chu了le問wen題ti或huo試shi劑ji出chu了le問wen題ti。應ying一yi一yi尋xun找zhao原yuan因yin。陽yang性xing對dui照zhao包bao括kuo兩liang種zhong
，一yi種zhong稱cheng為wei“自身對照”或“內部對照”
，這是指在測試的切片中本身就存在已知的抗原
，如正常淋巴結中存在T和B細胞抗原，CD20或CD3都(dou)應(ying)該(gai)有(you)表(biao)達(da)。自(zi)身(shen)對(dui)照(zhao)是(shi)一(yi)種(zhong)比(bi)較(jiao)理(li)想(xiang)的(de)對(dui)照(zhao)，對(dui)照(zhao)和(he)測(ce)試(shi)組(zu)織(zhi)或(huo)細(xi)胞(bao)都(dou)在(zai)同(tong)一(yi)張(zhang)切(qie)片(pian)中(zhong)，都(dou)處(chu)於(yu)相(xiang)同(tong)的(de)試(shi)驗(yan)條(tiao)件(jian)下(xia)，結(jie)果(guo)更(geng)可(ke)靠(kao)也(ye)更(geng)具(ju)有(you)可(ke)比(bi)性(xing)。在(zai)選(xuan)擇(ze)自(zi)身(shen)對(dui)照(zhao)片(pian)時(shi)最(zui)好(hao)選(xuan)擇(ze)既(ji)有(you)病(bing)變(bian)組(zu)織(zhi)同(tong)時(shi)又(you)有(you)正(zheng)常(chang)組(zu)織(zhi)的(de)部(bu)分(fen)，這(zhe)樣(yang)有(you)利(li)於(yu)對(dui)比(bi)。另(ling)一(yi)種(zhong)稱(cheng)為(wei)“外部對照”，有時在測試的切片中不存在已知的抗原，如在胃的標本中懷疑是惡性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1來lai檢jian測ce，在zai正zheng常chang的de胃wei組zu織zhi中zhong本ben身shen不bu存cun在zai相xiang關guan的de抗kang原yuan，如ru果guo病bing變bian出chu現xian陽yang性xing反fan應ying結jie果guo，尚shang能neng提ti示shi是shi惡e黑hei
，但dan是shi如ru果guo出chu現xian陰yin性xing結jie果guo，就jiu無wu法fa確que定ding是shi本ben身shen組zu織zhi中zhong不bu含han黑hei色se素su瘤liu抗kang原yuan
，還hai是shi技ji術shu問wen題ti。因yin此ci，應ying另ling外wai設she立li一yi個ge已yi知zhi的de陽yang性xing對dui照zhao。這zhe種zhong在zai測ce試shi組zu織zhi之zhi外wai的de陽yang性xing對dui照zhao稱cheng為wei“外部對照”。在(zai)實(shi)際(ji)工(gong)作(zuo)中(zhong)需(xu)要(yao)設(she)立(li)外(wai)部(bu)對(dui)照(zhao)的(de)情(qing)況(kuang)很(hen)多(duo)，如(ru)果(guo)每(mei)一(yi)種(zhong)抗(kang)體(ti)都(dou)要(yao)選(xuan)不(bu)同(tong)的(de)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)，工(gong)作(zuo)量(liang)會(hui)很(hen)大(da)。為(wei)了(le)解(jie)決(jue)這(zhe)個(ge)問(wen)題(ti)，目(mu)前(qian)國(guo)內(nei)外(wai)有(you)單(dan)位(wei)將(jiang)多(duo)種(zhong)不(bu)同(tong)組(zu)織(zhi)集(ji)成(cheng)在(zai)一(yi)起(qi)，製(zhi)成(cheng)多(duo)組(zu)織(zhi)切(qie)片(pian)、“臘腸”“春卷”切片、zuzhixinpiandeng，qilianxuqiepianchubeidaiyong，xuyaoshiquchuyizhangbiankezuoweiyangxingduizhao。lingwai，bijiaojiandandefangfa，shicaiyonglanweizuoweiyangxingduizhao，yinweiyurentiqitazuzhiqiguanbijiaolanweibaohandezuzhizhongleijiaoduo，ruyoushangpi、淋巴組織

、平滑肌
、間質、神經
、血管、間皮等。一張闌尾切片可以檢測大多數常用的抗體。

 

      設立陽性對照是病理醫生的任務或責任，而不是技術員的責任。病理醫生觀察了HEqiepian，lejieqiepianzhongshifouyouzishenduizhao
，ruguomeiyou，jiuyinggaosujishuyuancaiyongyangxingduizhao。yinci
，bingliyishengzaimianyizuhuazhongdezuoyongshibukehushide。kangtiweifugaishangceshizuzhi：當多塊散開的小組織染色時，可能漏掉某塊組織染色。

 

二、“雜音”染色片

 

      免疫組化除正常的真實的陽性信號外常常會遇到不正常的背景著色，這些非正常的著色稱為“雜音”染色。“雜音”染色種類繁多，產生的原因也多種多樣，為了便於說明，筆者將其歸納為下麵幾種。

 

1、全片著色

 

      全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之

，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現這種現象的原因有：

 

      （1）抗體濃度過高：yikangnongduguogaoshichangjiandeyuanyinzhiyi。jiejuebanfashi
，meicishiyongxinkangtiqianyingdangduiqigongzuonongdujinxingceshi，shimeiyikangtigetihua
，zhaodaoshihezijishiyanshidelixianggongzuonongdu，jishishijiyongxingdekangtiyeyingruci
，bunengzhijiandandeanshuomingshujinxingranse。

 

      （2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執行操作規程

，最好隨身佩帶報時表或報時鍾，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統的1小時，而是30分鍾，因此，要根據染色結果進行調整。

 

      （3）DAB變質和顯色時間太長：DAB最好現用現配，如有沉渣應進行過濾後再用。配製好的DAB不應存放時間太長，因為在沒有酶的情況下


，過氧化氫也會遊離出氧原子與DAB產生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱裏幾天後再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DABdexiansezuihaozaixianweijingxiajiankong，dadaolixiangderansechengdushilijizhongzhifanying。buguodangransepiantaiduoshihuoyongransejishi，zheyangzuosihubuxianshi，danzhishaoyingduiyixiexindehuoshaoyongdekangtixianseshijinxingjiankong，bimianxianseshijianguochang。

 

      （4）組織變幹：修複液溢出後未及時補充液體
、染色切片太多

、動作太慢、忘記滴液
、滴液流失等都是造成組織變幹的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAPPen在組織周圍畫圈
，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

 

      （5）切片在緩衝液或修複液中浸泡時間太長（大於24小時）：原yuan因yin上shang不bu清qing楚chu，但dan現xian象xiang存cun在zai。有you的de實shi驗yan室shi喜xi歡huan前qian一yi天tian將jiang切qie片pian脫tuo蠟la至zhi修xiu複fu，第di二er天tian加jia抗kang體ti進jin行xing免mian疫yi組zu化hua染ran色se，如ru果guo將jiang裝zhuang有you切qie片pian和he修xiu複fu液ye的de容rong器qi放fang在zai4度冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現背景著色，因此，不可存放時間太長。

 

      （6）一抗變質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麽不顯色要麽背景著色。用新買的抗體時最好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。

2、切片邊緣著色

 

      切片邊緣著色也是一種常見的現象
，這種現象稱為邊緣效應。產生的原因：（1）組織邊緣與玻片粘貼不牢
，邊緣組織鬆脫漂浮在液體，每次清洗不易將組織下麵試劑洗盡所致。解決辦法：製備優質的膠片（APES或多聚賴氨酸）
，切出盡量薄的組織切片，不厚於4微米，組織的前期處理應規範，盡量避免選用壞死較多的組織。（2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織
，邊緣的試劑容易首先變幹
，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊緣2mm。用DAKO筆畫圈時
，為了避免油劑的影響
，畫圈應距組織邊緣3-4mm。

 

3、“陰陽臉”著色

 

      zhizuzhiyibanzheseyibanwuzhese，xingchengjiaojieqingxihuobushenqingxideliangzhongransejieguo。qichengyinshishijijinfugailebufenzuzhierbushiquanbu。rujiashijihouweirangshijiliusankaierjizhongzaibufenzuzhishang。tongchangyinggaizaijiawanshijihou

，zaixikanyibian，shifouyoudezuzhiweibeishijiwanquanfugai，ruyouzhezhongqingkuang
，jianyiyongyaqianerbushiyongxitouhuoshijipingkoujiangshijiyinliukaishizhijiangzuzhiquanbufugai。lingwai
，ranpianhebuping，qiepianqingxie，suirankaishishijiyiquanbufugailezuzhi
，danhoulaishijiliuxiangyibian，bufenzuzhiweibeishijifugai。duiyuzhezhongwenti，zhiyaoliuxinhuoxiangdaolehenrongyifaxian，yehenrongyijiejue。youshi，yongDAKO（或PAP）bizaizuzhizhouweihuaquanshi

，huaxiantaikaojinhuohuadaolezuzhishang，youyubiyoudelixueyuanli，shijibunengdadaokaojinhuaxianfujindezuzhi。haiyouqipaoyekeyinqiyinyangfenmingdezhese，zhishibuzhesequyushiyuanxing，youyuqipaozhonghanqi，shijibeituidaozhouwei
，yinci

，qipaozhongxindezuzhibuzhese。jiejuebanfashidijiashijishishoufayaoqing，youqipaoshiyongyaqiantongpo。

 

4、灶片狀著色

 

      切片中著色區東一塊西一塊
，呈灶片狀分布，出現這種問題的原因有：（1）biaopianshishuiweipaijin，zaijubuxingchengqipaoshizuzhituqi，ranseshishijishenruhoubuyixijin
，xianseguoshensuozhi。jiejuebanfashi，piaopianhelideqipaoyingqujin，liangpianretaibunengpingfang
，yingyou45度左右的斜度，利於水流走和蒸發。（2）壞死組織灶

，組織壞死後細胞破壞、酶的釋放

、蛋白遊離、分解，複雜的肽鏈殘段（如Fc段）可能與一抗或/和二抗結合導致最終著色。解決辦法是在選擇染色切片時應避免選擇壞死組織較多的切片。（3）製作APES膠片時

，膠的濃度太高，幹燥後在玻片上留下白色小點，顯色時白色小點著色。解決辦法是按照標準的製備方法進行
，即5%鹽酸酒精（5ml鹽酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小時
、熱水衝洗玻片1小時

、蒸餾水洗玻片1分鍾、丙酮浸泡玻片5秒鍾後空氣幹燥（室溫）、2% APES（2ml APES+98ml丙酮）浸泡玻片5分鍾、玻片過一下丙酮（1-2秒鍾）、玻片過一下蒸餾水（1-2秒鍾）
、37 度過夜幹燥
、室溫儲存備用。如果製片過程中，因丙酮逐漸揮發而膠變濃時可適當加入一些丙酮。

 

5、間質著色

 

      著(zhe)色(se)部(bu)位(wei)主(zhu)要(yao)在(zai)間(jian)質(zhi)
，間(jian)質(zhi)著(zhe)色(se)的(de)原(yuan)因(yin)很(hen)多(duo)
，如(ru)抗(kang)體(ti)與(yu)組(zu)織(zhi)中(zhong)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)因(yin)蛋(dan)白(bai)疏(shu)水(shui)基(ji)團(tuan)相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)形(xing)成(cheng)非(fei)特(te)異(yi)性(xing)的(de)連(lian)接(jie)而(er)著(zhe)色(se)
，加(jia)一(yi)抗(kang)前(qian)的(de)血(xue)清(qing)封(feng)閉(bi)這(zhe)一(yi)步(bu)就(jiu)是(shi)為(wei)了(le)避(bi)免(mian)非(fei)特(te)異(yi)型(xing)的(de)結(jie)合(he)。又(you)如(ru)血(xue)清(qing)中(zhong)的(de)免(mian)疫(yi)球(qiu)蛋(dan)白(bai)常(chang)常(chang)滲(shen)出(chu)到(dao)組(zu)織(zhi)間(jian)質(zhi)
，很(hen)容(rong)易(yi)與(yu)抗(kang)體(ti)結(jie)合(he)，造(zao)成(cheng)間(jian)質(zhi)著(zhe)色(se)，特(te)別(bie)是(shi)lambda和kapparanseshi。dangjiazhuangxianjiaozhiwaiyidaozuzhijianzhishi，zuojiazhuangxianqiudanbairanseyehuichuxianjianzhizhese。kangtibuchunhuokangtibeiwuranyekechuxianjianzhizhese，womenzengyudaoCD20抗體不純，除了染上B細胞外還染上了間質。

 

6
、細胞漿著色

 

      胞漿著色是所有“雜音”染ran色se中zhong最zui具ju有you欺qi騙pian性xing的de著zhe色se，著zhe色se區qu局ju限xian在zai細xi胞bao內nei，間jian質zhi無wu著zhe色se，看kan上shang去qu與yu真zhen實shi的de免mian疫yi反fan應ying著zhe色se幾ji乎hu一yi樣yang，很hen難nan區qu別bie。胞bao漿jiang裏li含han有you較jiao多duo的de蛋dan白bai質zhi

，因yin此ci，很hen多duo非fei特te異yi性xing的de染ran色se除chu了le見jian於yu間jian質zhi也ye可ke以yi出chu現xian在zai胞bao漿jiang中zhong。這zhe種zhong原yuan因yin造zao成cheng的de著zhe色se，可ke以yi通tong過guo血xue清qing封feng閉bi解jie決jue。還hai有you因yin內nei源yuan酶mei造zao成cheng的de著zhe色se，如ru血xue紅hong蛋dan白bai（紅細胞）、肌紅蛋白（肌細胞）、細胞色素（粒細胞、單核細胞）

、過氧化氫酶（肝、腎），這些可用過氧化氫進行封閉。巨噬細胞吞噬各種抗原物質或Fcpianduanerchuxianbaojiangzhese，zhezhongzhesebuyibimian，dankeyitongguoxingtaixuebianrenchujushixibaoeryinqizhongshi。neiyuanxingshengwusudezhesezuijuyouqipianxing，yinweitaguangfandecunzaiyuzuzhixibaozhong，womenyanjiujieguoxianshi：bingdongzuzhizhongcunzaineiyuanxingshengwusu
，jingfumalingudingshilabaomaihoushengwusubeifengbi，jiarekangyuanxiufuhouzaochengneiyuanxingshengwusubaolu，neiyuanxingshengwusubaoludeqiangduzaibutongdezuzhiyousuobutong，congruoyangxing（+）到強陽性（+++），內nei源yuan性xing生sheng物wu素su在zai組zu織zhi中zhong的de分fen布bu形xing式shi，既ji有you散san在zai分fen布bu也ye有you彌mi漫man分fen布bu，主zhu要yao以yi顆ke粒li狀zhuang形xing式shi存cun在zai於yu胞bao漿jiang中zhong，內nei源yuan性xing生sheng物wu素su廣guang泛fan存cun在zai於yu上shang皮pi源yuan性xing組zu織zhi
，特te別bie是shi腺xian上shang皮pi組zu織zhi，亦yi存cun在zai部bu分fen非fei上shang皮pi組zu織zhi，內nei源yuan性xing生sheng物wu素su不bu僅jin存cun在zai人ren體ti組zu織zhi也ye存cun在zai大da鼠shu組zu織zhi，內nei源yuan性xing生sheng物wu素su暴bao露lu的de強qiang弱ruo與yu修xiu複fu液ye有you關guan，其qi強qiang度du增zeng加jia依yi次ci為wei：檸檬酸、EDTA
、EGTA，熱抗原修複暴露的內源性生物素可被雞蛋清封閉，非生物素檢測係統Polymer兩步法（EliVision、EnVision）可避免生物素幹擾。

 

7、細胞核著色

 

      不適當的組織處理可以出現細胞核著色，如組織在二甲苯裏浸泡時間太長（如從星期五浸泡到下星期一）、緩衝液中浸泡時間太長、組織變幹、微波修複液的pH值和修複時間不當或修複過程中修複液留下得太少，未沒過組織等。解決辦法是嚴格按照操作常規進行工作。