當免疫組化染色沒有出現預期結果時，應係統地查找原因，而每一次隻能排除一種可能的原因。
對照/標本無染色
①確認是否忽略了應該加的某種試劑
，包括一抗
、二抗、三抗及底物等。
②確認所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時間。
③對dui照zhao抗kang體ti的de標biao簽qian確que認ren是shi否fou使shi用yong了le正zheng確que的de抗kang體ti
，以yi及ji所suo用yong的de檢jian測ce係xi統tong是shi否fou和he一yi抗kang匹pi配pei，這zhe一yi點dian是shi非fei常chang重zhong要yao的de。比bi如ru，如ru果guo一yi抗kang是shi兔tu來lai源yuan的de抗kang體ti
，二er抗kang一yi定ding要yao用yong抗kang兔tu的de二er抗kang來lai匹pi配pei；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必須是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液。
⑤檢查抗體的有效期和保存條件

，尤其是標記了酶或熒光素的抗體，現在大多數試劑公司的抗體均要求在4~8℃條件下保存，應避免反複凍融，試劑保存時一定要避免與揮發性有機溶劑同放一室

，以免降低抗體的效價。
⑥檢查標本的儲存條件

，最好用已知陽性的標本來同時做陽性對照。
⑦檢查色原/diwurongye，zuijiandandejiancefangfashijiangyidibiaojiyoumeidekangtijiarudaozhibeihaodediwurongyezhong，ruguodiwufashengyuqideyansebianhua，zekepaichudiwudeyinsu。xuyaozhuyideshi，youxiediwuzaizhichenggongzuoyehouyingzaiyidingshijianneiyongwan
，fouzehuishixiao。
⑧檢查衝洗液是否和反應試劑匹配
，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應含有疊氮鈉。
⑨檢查複染劑和封片劑是否和所使用的色原匹配。
弱陽性
如果陰性對照沒有染色而陽性對照標本弱陽性，除了考慮上述因素外
，還應考慮：
①標本的固定方式
，不當的固定方式或固定時溫度過高，都會影響到所檢測的抗原的數量和質量。
②不(bu)適(shi)當(dang)的(de)抗(kang)原(yuan)修(xiu)複(fu)方(fang)式(shi)，由(you)於(yu)石(shi)蠟(la)切(qie)片(pian)在(zai)製(zhi)作(zuo)的(de)過(guo)程(cheng)中(zhong)固(gu)定(ding)劑(ji)對(dui)抗(kang)原(yuan)的(de)封(feng)閉(bi)作(zuo)用(yong)，必(bi)須(xu)用(yong)抗(kang)原(yuan)熱(re)修(xiu)複(fu)或(huo)酶(mei)消(xiao)化(hua)或(huo)兩(liang)種(zhong)同(tong)時(shi)使(shi)用(yong)的(de)抗(kang)原(yuan)雙(shuang)暴(bao)露(lu)法(fa)，至(zhi)於(yu)使(shi)用(yong)哪(na)一(yi)種(zhong)方(fang)法(fa)
，應(ying)參(can)照(zhao)生(sheng)產(chan)廠(chang)家(jia)的(de)說(shuo)明(ming)，同(tong)時(shi)結(jie)合(he)標(biao)本(ben)的(de)具(ju)體(ti)情(qing)況(kuang)而(er)定(ding)。
③抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時(shi)間(jian)是(shi)否(fou)正(zheng)確(que)。一(yi)般(ban)試(shi)劑(ji)生(sheng)產(chan)廠(chang)家(jia)都(dou)會(hui)對(dui)試(shi)劑(ji)給(gei)出(chu)一(yi)定(ding)的(de)使(shi)用(yong)範(fan)圍(wei)
，但(dan)是(shi)由(you)於(yu)使(shi)用(yong)者(zhe)的(de)標(biao)本(ben)來(lai)自(zi)各(ge)種(zhong)組(zu)織(zhi)

，處(chu)理(li)過(guo)程(cheng)也(ye)不(bu)盡(jin)相(xiang)同(tong)
，所(suo)以(yi)應(ying)參(can)照(zhao)使(shi)用(yong)範(fan)圍(wei)，對(dui)所(suo)使(shi)用(yong)的(de)一(yi)抗(kang)進(jin)行(xing)梯(ti)度(du)測(ce)試(shi)，找(zhao)出(chu)最(zui)佳(jia)的(de)使(shi)用(yong)濃(nong)度(du)。
④切片上遺留了過多的衝洗液，當抗體加至切片上時


，等於人為地對抗體進行了進一步的稀釋。
⑤孵育時切片是否放置水平，否則會導致抗體流失。
如果陰性對照沒有反應，陽性對照反應良好，而標本弱陽性，則可能是由於陽性對照不是同一種組織、或固定方式不同等原因所致。
非特異性染色
①是shi否fou有you效xiao地di去qu除chu了le內nei源yuan性xing酶mei和he生sheng物wu素su。應ying注zhu意yi的de是shi

，並bing不bu是shi每mei一yi種zhong組zu織zhi均jun需xu要yao進jin行xing此ci步bu驟zhou
，但dan對dui於yu內nei源yuan性xing酶mei或huo生sheng物wu素su豐feng富fu的de組zu織zhi，如ru肝gan髒zang
、腎髒等，需考慮此原因。處理的方法為：
滅活堿性磷酸酶：最常用的方法是將左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，並保持pH值在7.6~8.2
，即能除去大部分內源性堿性磷酸酶，對於仍能幹擾染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑製。
飽和處理內源性生物素：消除內源性生物素的方法是事先滴加親和素，以飽和內源性生物素，使之不再有剩餘的結合位點。具體方法是在ABC法或SP法染色前將切片浸於25ug/ml親和素溶液中處理15分鍾，PBS清洗15分鍾後即可染色。
②是否選擇使用了正確的封閉血清。電荷吸附所造成的非特異性背景染色消除方法是以二抗動物的非免疫血清，用PBS稀釋為3%-10%溶液孵育切片，以封閉吸附位點。有時其它無關蛋白，如牛血清白蛋白也常應用。另外，取材時避開出血、壞死區亦極重要。最近有些國內的實驗室應用5%脫脂奶粉替代血清進行抗原封閉，效果也不錯。
③所選擇的抗體是否符合試驗要求。因抗原不純
、標本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異性染色隻能通過采用高純度
、高效價的抗體、或針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。
④一抗的使用濃度是否過高。
⑤清洗是否充分。應嚴格操作規程。因在緩衝液中含有一定量的鹽
，這亦有利於減低背景著色

，通常0.05mol/l Tris—HCl
，0.15mol/l NaCl已適用於多數染色方法
，溶液內加入吐溫20，效果更佳。特殊標記時，試劑公司一般都提供緩衝液的配方。
⑥ DBA的使用是否正確。DAB的孵育時間和配製方式可以產生某些背景顏色
，使用濃縮型DAB試劑盒時
，請嚴格按照說明書標明的滴加順序操作，注意校正蒸餾水的pH值
，以確保實驗結果的正確性；粉劑DAB溶解時，常有一些不溶性顆粒，這些顆粒須經過濾除去
，否則可能沉積於切片組織上，產生斑點狀著色。另外，DAB保存不妥產生氧化物亦可沉積於切片上
，因此需將DAB保存於避光幹燥處
，現用現配
，臨用前加H2O2。孵育時間過長也會造成背景染色。
⑦標本染色過程中是否曾經幹涸，否則會造成邊緣部的非特異性染色。
⑧檢查二抗與標本的內源性組織蛋白是否有交叉反應。