氫氘交換質譜法是一種研究蛋白質空間構象的質譜技術。它在蛋白質結構及動態變化研究、蛋白質相互作用位點發現、danbaibiaoweijihuoxingweidianjiandingfangmianyouzheguangfandeyingyong。suizheqingdaojiaohuanzhipujishudebuduanfazhan，tazhengzaichengweijiegoushengwuxuejiajishengwuyaowuyanfadezhongyaoshouduan。

 

氫氘交換質譜（HDX MS
，hydrogen deuterium exchange mass spectrometry）shiyizhongyanjiudanbaizhikongjiangouxiangdezhipujishu。qiyuanlishijiangdanbaijinruzhongshuirongyezhong，danbaideqingyuanzijiangyuzhongshuidedaoyuanzifashengjiaohuan，erqiedanbaizhibiaomianyuzhongshuimiqiejiechudeqingbiweiyudanbaizhineibudehuocanyuqingjianxingchengdeqingdejiaohuansulvkuai，jinertongguozhipujiancequedingdanbaizhibutongxuliepianduandeqingdaojiaohuansulv，congerdechudanbaizhikongjianjiegouxinxi[1]。這個過程就像將握著的拳頭浸入水中
，然後提出水麵並張開手掌。這時，濕潤的手背表明它在“拳頭”的結構中處於外表麵，而較為幹燥的手心表明它是“拳頭”的內部。除樣品製備外，氫氘交換質譜法的主要過程包括：交換反應

、終止反應、將蛋白快速酶切為多肽、液相分離、質譜檢測、數據解析。其中交換步驟需要在多個反應時長下進行，如0s、10s、1min
、10min、60min等，以繪製交換率曲線
，得到準確全麵的信息。氫氘交換質譜技術在蛋白質結構及其動態變化研究[1]、蛋白質相互作用位點發現[2]、蛋白表位及活性位點鑒定方麵有著廣泛的應用[3]。

 

與經典的蛋白質結構研究方法相比，如X射線晶體衍射（X-Ray Crystallography）和核磁共振（NMR. Nuclear Magnetic Resonance）等方法，氫氘交換質譜不能夠提供精確的蛋白空間結構，它直接提供的主要信息包括哪些氨基酸序列位於蛋白質空間結構的表麵位置（包括動態變化中的）、可能的活性位點和蛋白-蛋白相互作用位點等。但是氫氘交換質譜技術有著其他經典方法不具備的優點：首先
，可以進行蛋白質結構動態變化的研究是氫氘交換質譜的一個突出優點，包括變化中的活性位點及表位；其次，氫氘交換質譜在蛋白複合體構象的研究中也具有獨到的優勢；此外，氫氘交換質譜還具有對樣品需求量小、純度要求相對較低
、研究對象為溶液環境下的蛋白質的天然構象而非晶體中構象等優勢[1,4,5]。自1991年第一篇研究論文發表起，氫氘交換質譜技術不斷發展，已經成為結構生物學及質譜技術中一個非常重要的應用領域[6]。但是氫氘交換質譜實驗的複雜的實現過程在一定程度上影響了其應用的廣泛度。主要的難點有：1、如何避免交換後氘代肽段的回交現象；2、實驗控製的高精確性和重現性要求；3、交換後造成的疊加的質譜峰如何準確分辨；4、簡易高效的分析軟件需求；5、以氨基酸為單位的交換位點辨析。沃特世公司自2005年起
，針對以上難點不斷進行攻關，推出了目前唯一商業化的全自動氫氘交換質譜係統解決方案--nanoACQUITY UPLC? HD-Exchange System(圖1)。在全世界範圍內，這套係統已經幫助科學家在包括Cell、Nature等頂級研究期刊中發表研究論文[7,8]。chukeyanxuqiuwai
，woteshiqingdaojiaohuanzhipuxitongyeshoudaozhongduoguojilingxianzhiyaogongsiderenke，bingyongyuxinyaokaifazhongdanbaiyaowuhuoxingweidianjibiaoweideyanjiugongzuozhong。

 

氫氘交換實驗中的回交現象將嚴重影響實驗數據的可信度
，甚至導致錯誤結果的產生。要避免回交需要做到兩點：盡量縮短液質分析時間和保證液質分析中的溫度和pH為最低回交反應係數所要求的環境。沃特世UPLC?係統采用亞二納米色譜顆粒填料
，較HPLC使用的大顆粒填料
，UPLC具有無與倫比的分離度。因此UPLC可以做到在不損失色譜分離效果的要求下，極大縮短液相分析時間的要求[9]。對於對溫度和pH控製問題，在多年的工程學改進中，nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System已經實現了對酶切、液相分離等步驟的全程控製[10]。

 

對氫氘交換質譜實驗精確性和重現性的要求是其應用的第二個主要難點。在實驗中一般需要采集0s、10s

、1min


、10min
、60min、240min等多個時間點的數據。如果進行人工手動實驗，很難做到對10S-10min等deng幾ji個ge時shi間jian點dian的de精jing確que操cao作zuo。再zai考kao慮lv到dao重zhong複fu實shi驗yan的de需xu求qiu，人ren工gong手shou動dong操cao作zuo會hui對dui最zui終zhong數shu據ju可ke信xin度du產chan生sheng影ying響xiang。而er且qie實shi驗yan過guo程cheng重zhong複fu繁fan瑣suo，將jiang給gei實shi驗yan人ren員yuan帶dai來lai非fei常chang大da的de工gong作zuo壓ya力li。nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System完全通過智能機械臂，精確完成交換
、終止交換、進樣、酶(mei)切(qie)等(deng)一(yi)係(xi)列(lie)實(shi)驗(yan)過(guo)程(cheng)
，而(er)且(qie)始(shi)終(zhong)保(bao)證(zheng)各(ge)個(ge)步(bu)驟(zhou)所(suo)需(xu)不(bu)同(tong)的(de)溫(wen)度(du)環(huan)境(jing)。這(zhe)些(xie)自(zi)動(dong)化(hua)過(guo)程(cheng)不(bu)但(dan)保(bao)證(zheng)了(le)實(shi)驗(yan)數(shu)據(ju)的(de)可(ke)靠(kao)性(xing)，提(ti)高(gao)了(le)實(shi)驗(yan)效(xiao)率(lv)，也(ye)將(jiang)科(ke)學(xue)家(jia)從(cong)繁(fan)瑣(suo)的(de)重(zhong)複(fu)實(shi)驗(yan)中(zhong)解(jie)放(fang)出(chu)來(lai)。

 

氫qing氘dao交jiao換huan實shi驗yan的de質zhi譜pu數shu據ju中zhong，隨sui著zhe交jiao換huan時shi間jian的de延yan長chang
，發fa生sheng了le交jiao換huan反fan應ying的de多duo肽tai
，由you於yu質zhi量liang變bian大da，其qi質zhi譜pu信xin號hao將jiang逐zhu漸jian向xiang高gao質zhi荷he比bi方fang向xiang移yi動dong。因yin此ci，這zhe些xie質zhi譜pu峰feng可ke能neng與yu哪na些xie未wei發fa生sheng交jiao換huan反fan應ying的de多duo肽tai質zhi譜pu峰feng逐zhu漸jian疊die加jia、相xiang互hu覆fu蓋gai。相xiang互hu疊die加jia的de質zhi譜pu信xin號hao，不bu但dan影ying響xiang對dui峰feng歸gui屬shu的de判pan斷duan
，更geng會hui增zeng加jia交jiao換huan率lv數shu據ju的de誤wu差cha。因yin為wei交jiao換huan率lv判pan斷duan需xu要yao通tong過guo對dui發fa生sheng交jiao換huan的de多duo肽tai進jin行xing定ding量liang，毫hao無wu疑yi問wen因yin疊die加jia的de而er混hun亂luan的de質zhi譜pu數shu據ju將jiang極ji大da的de影ying響xiang對dui質zhi譜pu峰feng的de準zhun確que定ding量liang。這zhe點dian對dui於yu單dan純chun通tong過guo質zhi荷he比bi進jin行xing分fen析xi的de質zhi譜pu儀yi來lai說shuo完wan全quan無wu能neng為wei力li。但dan是shi
，這zhe個ge看kan似si不bu可ke能neng完wan成cheng的de任ren務wu卻que被bei沃wo特te世shi nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System攻克了。這是因為，不同於其它常見質譜，沃特世的SYNAPT?質譜平台還具備根據離子大小及形態進行分離的功能（行波離子淌度分離）。在數據處理時
，除多肽離子的質荷比信息外，還可以通過離子遷移時間（離子淌度維度參數）將不同離子區分。因此這種SYNPAT獨有的被命名為HDMSE的質譜分析技術可以將因質荷比相同而重疊的多肽分離開，輕而易舉地解決了質譜信號疊加的問題
，得到準確的交換率數據[11,12]（圖2）。SYNPAT質譜平台一經推出就奪得了2007年PITTCON金獎

，目前已經推出了新一代的SYNAPT G2HDMS、SYNAPT G2-S HDMS等型號，並具備ESI、MALDI等多種離子源。除氫氘交換技術外，SYNAPT質譜係統在蛋白質複合體結構研究中也是獨具特色

，已有多篇高質量應用文獻發表[13,14,15]。

實(shi)現(xian)氫(qing)氘(dao)交(jiao)換(huan)質(zhi)譜(pu)技(ji)術(shu)的(de)第(di)四(si)個(ge)關(guan)鍵(jian)點(dian)，是(shi)如(ru)何(he)高(gao)效(xiao)分(fen)析(xi)實(shi)驗(yan)產(chan)生(sheng)的(de)多(duo)時(shi)間(jian)點(dian)及(ji)多(duo)次(ci)重(zhong)複(fu)帶(dai)來(lai)的(de)大(da)量(liang)數(shu)據(ju)。人(ren)工(gong)完(wan)成(cheng)如(ru)此(ci)巨(ju)大(da)的(de)信(xin)息(xi)處(chu)理(li)工(gong)作(zuo)，將(jiang)消(xiao)耗(hao)科(ke)學(xue)家(jia)大(da)量(liang)的(de)時(shi)間(jian)。沃(wo)特(te)世(shi)氫(qing)氘(dao)交(jiao)換(huan)質(zhi)譜(pu)解(jie)決(jue)方(fang)案(an)所(suo)提(ti)供(gong)的(de)DynamX軟件可以為科學家提供簡便直觀的分析結果，並包含多種呈現方式。

 

在某些特殊研究中，要求對蛋白氫氘交換位點做到精確到氨基酸的測量
，這是氫氘交換質譜研究的又一個難點。在常規的研究中采用CID（碰撞誘導解離）碎裂模式，可能導致氘原子在多肽內重排，而致使不能對發生交換的具體氨基酸進行精確定位。SYNPAT質譜提供的ETD（電子轉移解離）碎裂模式可以避免氘原子重排造成的信息混亂，並具有良好的碎裂信號[16]。

沃特世的nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System為氫氘交換質譜實驗提供了前所未有的簡易的解決方案，強有力地推動了氫氘交換技術在蛋白質結構及動態變化研究、蛋白質相互作用位點發現
、蛋白表位以及活性位點鑒定方麵的應用，正在成為眾多結構生物學科學家和生物製藥企業必不可少的工作平台。