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（1）一方麵，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；
（2）另一方麵，使抗原抗體結合更穩定。一般不需要，但對表達較弱的抗原可能有用，4度和37度時分子運動方式不同，前者分子碰撞機率和運動速度小於後者，後者結合更快，但敏感性也提高了並易造成非特異染色。
（3）其實，我更讚同後一種說法，因為我嚐試把肝髒或睾丸片子從4度過夜拿出後，直接用PBS洗沒發生過脫片現象。
2、切片染色後背景太深，如何區分特異性與非特異性著色？
全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現這種現象的原因有：
（1）抗體濃度過高：一(yi)抗(kang)濃(nong)度(du)過(guo)高(gao)是(shi)常(chang)見(jian)的(de)原(yuan)因(yin)之(zhi)一(yi)。解(jie)決(jue)辦(ban)法(fa)是(shi)，每(mei)次(ci)使(shi)用(yong)新(xin)抗(kang)體(ti)前(qian)應(ying)當(dang)對(dui)其(qi)工(gong)作(zuo)濃(nong)度(du)進(jin)行(xing)測(ce)試(shi)，使(shi)每(mei)一(yi)抗(kang)體(ti)個(ge)體(ti)化(hua)，找(zhao)到(dao)適(shi)合(he)自(zi)己(ji)實(shi)驗(yan)室(shi)的(de)理(li)想(xiang)工(gong)作(zuo)濃(nong)度(du)，既(ji)使(shi)是(shi)即(ji)用(yong)型(xing)的(de)抗(kang)體(ti)也(ye)應(ying)如(ru)此(ci)，不(bu)能(neng)隻(zhi)簡(jian)單(dan)的(de)按(an)說(shuo)明(ming)書(shu)進(jin)行(xing)染(ran)色(se)。
（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執行操作規程，最好隨身佩帶報時表或報時鍾，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統的1小時，而是30分鍾，因此，要根據染色結果進行調整。
（3）DAB變質和顯色時間太長：DAB最好現用現配，如有沉渣應進行過濾後再用。配製好的DAB不應存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會遊離出氧原子與DAB產生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱裏幾天後再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DAB的de顯xian色se最zui好hao在zai顯xian微wei鏡jing下xia監jian控kong，達da到dao理li想xiang的de染ran色se程cheng度du時shi立li即ji終zhong止zhi反fan應ying。不bu過guo當dang染ran色se片pian太tai多duo時shi或huo用yong染ran色se機ji時shi，這zhe樣yang做zuo似si乎hu不bu現xian實shi，但dan至zhi少shao應ying對dui一yi些xie新xin的de或huo少shao用yong的de抗kang體ti顯xian色se時shi進jin行xing監jian控kong，避bi免mian顯xian色se時shi間jian過guo長chang。
（4）組織變幹：修複液溢出後未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變幹的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。
（5）切片在緩衝液或修複液中浸泡時間太長（大於24小時）：原yuan因yin上shang不bu清qing楚chu，但dan現xian象xiang存cun在zai。有you的de實shi驗yan室shi喜xi歡huan前qian一yi天tian將jiang切qie片pian脫tuo蠟la至zhi修xiu複fu，第di二er天tian加jia抗kang體ti進jin行xing免mian疫yi組zu化hua染ran色se，如ru果guo將jiang裝zhuang有you切qie片pian和he修xiu複fu液ye的de容rong器qi放fang在zai4oC冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現背景著色，因此，不可存放時間太長。
（6）一抗變質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麽不顯色要麽背景著色。用新買的抗體時最好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。
3、脫片產生的原因有哪些？
（1）多(duo)聚(ju)賴(lai)氨(an)酸(suan)玻(bo)片(pian)質(zhi)量(liang)的(de)問(wen)題(ti)。我(wo)原(yuan)先(xian)是(shi)買(mai)的(de)，邁(mai)新(xin)按(an)說(shuo)也(ye)是(shi)不(bu)錯(cuo)的(de)，可(ke)是(shi)都(dou)脫(tuo)成(cheng)什(shen)麼(me)樣(yang)子(zi)了(le)。後(hou)麵(mian)補(bu)做(zuo)第(di)二(er)批(pi)時(shi)用(yong)的(de)病(bing)理(li)科(ke)老(lao)師(shi)自(zi)己(ji)做(zuo)的(de)片(pian)子(zi)，要(yao)好(hao)一(yi)點(dian)。
（2）組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。
（3）沒烤好，時間短，溫度不夠之類。
（4）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛生紙從邊緣上慢慢吸水。
（5）修複的問題：抗原修複的時候高壓時間過長了，或者放進100度的修複液時手法不好，咚的一聲就丟進去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修複比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，隻有從另外的問題上著手。
（6）一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用PBS的時候盡量用泡的，不要衝。基本上把這些方麵都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。
（7）組織的問題，我用的組織癌症的很多，越是癌症組織有壞死之類越容易脫。
4、免疫組化中抗原修複的最佳條件是什麼？（尤其是微波修複）
關於抗原修複，我試過的修複條件有EDTA熱修複，檸檬酸鈉為緩衝液的微波修複以及高壓鍋修複。從我的實驗結果來看，微波修複其實很不容易掉片子的，而EDTArexiufuhegaoyaguoxiufushihenrongyidiaopianzide。yinweidiaopianzizhuyaoshiyinweijiareguochengzhongchanshengdeqipaosuoyinqi，erweiboxiufushuijiaredaofeiteng，zhanzaipianzishangdeqipaojiuhuishao，buhuiyinweixiaoqipaoshangchuanyinqituopian。zuoEDTA修(xiu)複(fu)時(shi)，你(ni)可(ke)以(yi)將(jiang)片(pian)子(zi)靠(kao)的(de)盡(jin)量(liang)近(jin)些(xie)，或(huo)是(shi)在(zai)載(zai)玻(bo)片(pian)四(si)周(zhou)墊(dian)些(xie)棉(mian)花(hua)什(shen)麼(me)的(de)，然(ran)後(hou)蓋(gai)上(shang)蓋(gai)玻(bo)片(pian)，這(zhe)樣(yang)修(xiu)複(fu)的(de)話(hua)就(jiu)能(neng)夠(gou)盡(jin)量(liang)減(jian)少(shao)載(zai)玻(bo)片(pian)上(shang)小(xiao)氣(qi)泡(pao)的(de)形(xing)成(cheng)。我(wo)們(men)用(yong)的(de)微(wei)波(bo)修(xiu)複(fu)條(tiao)件(jian)為(wei)：2.94g檸檬酸三鈉溶於1000ml的水，調PH值至6.0，微波修複10分鍾。你可以試試，時間可以根據需要自己調整。對於檸檬酸修複來說，隻要高壓修複時間控製在加閥冒氣後90秒，冷水下終止開高壓鍋蓋，高壓修複和微波修複一樣不掉片子，而且一般高壓修複效果往往更好一點；關於EDTA熱修複，一般說明書上都講的是PH值等於9，實際上我試過，如果單傳用EDTA，很容易掉片子，但是用Tris-EDTA,一般就不會掉片子了，Tris-base的濃度為0.05mmol/L,高壓和微波修複都可以，PH也等於9。
5、DAB顯色後發現切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？
著色不均勻可能與你的實驗手法有很大關係，可能原因有：
（1）切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一。
（2）有you可ke能neng是shi你ni的de顯xian色se液ye底di物wu加jia到dao片pian子zi上shang後hou沒mei有you搖yao勻yun，造zao成cheng局ju部bu底di物wu濃nong度du不bu一yi致zhi，所suo以yi加jia完wan顯xian色se液ye後hou最zui好hao將jiang片pian子zi來lai回hui左zuo右you晃huang動dong幾ji下xia，使shi片pian子zi上shang所suo有you區qu域yu的de底di物wu濃nong度du一yi致zhi。
（3）ruguonidepianzishizhongjianderanseshen，kaojinbianshangdeqian，nayoukenengshinilaquanhuadetaixiao，xianseyefugaidemianjibuguodaerchanshenglebianyuanxiaoying。zuiwaicedezuzhipianzuihaolixianseyewaiyuan0.5cm。
