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紫外光激發熒光物質放射熒光示意圖
免疫熒光實驗的主要步驟包括細胞片製備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片製備（通俗的說法是細胞爬片）是shi免mian疫yi熒ying光guang實shi驗yan的de第di一yi步bu，細xi胞bao片pian的de質zhi量liang對dui實shi驗yan的de成cheng敗bai至zhi關guan重zhong要yao，原yuan因yin很hen簡jian單dan，如ru果guo發fa生sheng細xi胞bao掉diao片pian，一yi切qie都dou無wu從cong談tan起qi。這zhe一yi步bu關guan鍵jian的de是shi玻bo片pian（Slides or Coverslips）的de處chu理li以yi及ji細xi胞bao的de活huo力li，有you人ren根gen據ju成cheng功gong經jing驗yan總zong結jie出chu許xu多duo有you益yi的de細xi節jie或huo小xiao竅qiao門men，非fei常chang值zhi得de借jie鑒jian。固gu定ding和he通tong透tou步bu驟zhou最zui重zhong要yao的de是shi根gen據ju所suo研yan究jiu抗kang原yuan的de性xing質zhi選xuan擇ze適shi當dang的de固gu定ding方fang法fa，合he適shi的de固gu定ding劑ji和he固gu定ding程cheng序xu對dui於yu獲huo得de好hao的de實shi驗yan結jie果guo是shi非fei常chang重zhong要yao的de。免mian疫yi熒ying光guang中zhong的de封feng閉bi和he抗kang體ti孵fu育yu與yu其qi它ta方fang法fa（如ELISA或Western Blot）中(zhong)的(de)相(xiang)同(tong)步(bu)驟(zhou)是(shi)類(lei)似(si)的(de)，最(zui)重(zhong)要(yao)的(de)區(qu)別(bie)在(zai)於(yu)免(mian)疫(yi)熒(ying)光(guang)實(shi)驗(yan)中(zhong)要(yao)用(yong)到(dao)熒(ying)光(guang)抗(kang)體(ti)，因(yin)此(ci)必(bi)須(xu)謹(jin)記(ji)避(bi)光(guang)操(cao)作(zuo)，此(ci)外(wai)抗(kang)體(ti)濃(nong)度(du)的(de)選(xuan)擇(ze)可(ke)能(neng)更(geng)加(jia)關(guan)鍵(jian)。最(zui)後(hou)需(xu)要(yao)注(zhu)意(yi)的(de)是(shi)，標(biao)記(ji)好(hao)熒(ying)光(guang)的(de)細(xi)胞(bao)片(pian)應(ying)盡(jin)早(zao)觀(guan)察(cha)，或(huo)者(zhe)用(yong)封(feng)片(pian)劑(ji)封(feng)片(pian)後(hou)在(zai)4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結果。
由於操作步驟比較多，同時在分析結果時無法像WB那na樣yang可ke以yi根gen據ju分fen子zi量liang的de大da小xiao區qu分fen非fei特te異yi性xing識shi別bie，所suo以yi要yao得de到dao一yi個ge完wan美mei的de免mian疫yi熒ying光guang實shi驗yan結jie果guo，除chu了le需xu要yao高gao質zhi量liang的de抗kang體ti，以yi及ji對dui實shi驗yan條tiao件jian進jin行xing反fan複fu優you化hua外wai，還hai必bi須xu設she立li嚴yan謹jin的de實shi驗yan對dui照zhao。總zong之zhi，免mian疫yi熒ying光guang實shi驗yan從cong細xi胞bao樣yang品pin處chu理li、固定、封閉、抗體孵育到最後的封片及觀察拍照，每步都非常關鍵，需要嚴格控製實驗流程中每個步驟的質量，才能最終達到你的實驗目的。
基本實驗步驟：
（1） xibaozhunbei。duidancengshengchangxibao，zaichuandaipeiyangshi，jiangxibaojiezhongdaoyuxianfangzhiyouchuliguodegaibopiandepeiyangminzhong，daixibaojiejinchangchengdancenghouquchugaibopian，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機製備細胞片或直接製備細胞塗片。
（2） 固定。根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢後的細胞可置於含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.
（3） 通透。使用交聯劑（如多聚甲醛）固(gu)定(ding)後(hou)的(de)細(xi)胞(bao)，一(yi)般(ban)需(xu)要(yao)在(zai)加(jia)入(ru)抗(kang)體(ti)孵(fu)育(yu)前(qian)，對(dui)細(xi)胞(bao)進(jin)行(xing)通(tong)透(tou)處(chu)理(li)，以(yi)保(bao)證(zheng)抗(kang)體(ti)能(neng)夠(gou)到(dao)達(da)抗(kang)原(yuan)部(bu)位(wei)。選(xuan)擇(ze)通(tong)透(tou)劑(ji)應(ying)充(chong)分(fen)考(kao)慮(lv)抗(kang)原(yuan)蛋(dan)白(bai)的(de)性(xing)質(zhi)。通(tong)透(tou)的(de)時(shi)間(jian)一(yi)般(ban)在(zai)5-15min.通透後用PBS洗滌3×5 min.
（4） 封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min.
（5） 一抗結合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次衝洗5min.
（6） 二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次衝洗5min後，再用蒸餾水漂洗一次。
（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
（一）細胞準備
yongyumianyiyingguangshiyandexibaokeyishizhijieshengchangzaigaibopianshangdetiebixibao，yekeyishijingguolixinhoutupiandexuanfuxibaohuozheshijiangquzitineidezuzhixibaoxuanyelixinhoutupian。tiebilianghaodexibaoyibanzaipeiyangshizhijiefangrucoverslips讓rang細xi胞bao生sheng長chang在zai其qi上shang即ji可ke，盡jin量liang避bi免mian使shi用yong貼tie壁bi性xing能neng不bu好hao的de細xi胞bao進jin行xing免mian疫yi熒ying光guang實shi驗yan，以yi免mian後hou續xu的de漂piao洗xi操cao作zuo引yin起qi細xi胞bao脫tuo落luo。少shao數shu實shi驗yan需xu要yao使shi用yong這zhe類lei細xi胞bao或huo者zhe懸xuan浮fu細xi胞bao進jin行xing免mian疫yi熒ying光guang觀guan察cha，建jian議yi使shi用yong細xi胞bao離li心xin甩shuai片pian機ji製zhi備bei細xi胞bao片pian或huo直zhi接jie製zhi備bei細xi胞bao塗tu片pian。
（二）固定和通透
除研究細胞表麵抗原或不穩定抗原可不固定外，一般均應固定。固定的目的有三：
①防止細胞從玻片上脫落；
②除去防礙抗原-抗體結合的類脂；
③使標本易於保存。
標本的固定原則是：
①不能損傷細胞內的抗原；
②不能凝集蛋白質；
③應保持細胞和亞細胞結構；
④固定後應保持通透性，以保證抗體自由進入所有細胞與亞細胞組分與抗原結合。
常用的固定劑有多種，應根據所研究抗原的性質和所使用的抗體特性選擇適當的固定劑。通常固定方法可以分為兩類：youjirongjihejiaolianji。youjirongjirujiachunhebingtongdengkequchuleizhibingshixibaotuoshui，tongshijiangxibaojiegoudanbaichendian。jiaolianjiruduojujiaquantongchangtongguoziyouanjisuanjituanxingchengfenzijianqiaolian，congerchanshengyizhongkangyuanxianghulianjiedewangluojiegou。jiaolianjibiyoujirongjigengyiyubaochixibaodejiegou，danyinweijiaolianzuaikangtijiehe，kenenghuijiangdiyixiexibaozufendekangyuanxing，yincixuyaozengjiayigetongtoubuzhouyishikangtinenggoujinrubiaoben。liangzhonggudingfangfadoukenengshidanbaikangyuanbianxing，yincishiyongbianxingdanbaizuoweikangyuanshengchandekangtizaimianyiyingguangzhongkenenggengweiyouxiao。
最常用的固定劑有多聚甲醛和甲醇，少數情況也使用乙醇，丙酮及戊二醛等進行固定。通常，細胞結構抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮、乙yi醇chun及ji高gao濃nong度du的de甲jia醛quan固gu定ding可ke獲huo得de較jiao好hao的de結jie果guo，而er細xi胞bao膜mo相xiang關guan組zu分fen抗kang原yuan一yi般ban以yi多duo聚ju甲jia醛quan固gu定ding。細xi胞bao器qi和he細xi胞bao顆ke粒li內nei的de抗kang原yuan一yi般ban也ye用yong多duo聚ju甲jia醛quan固gu定ding，並bing需xu要yao進jin行xing通tong透tou以yi使shi抗kang體ti能neng達da到dao抗kang原yuan表biao位wei。
通(tong)透(tou)步(bu)驟(zhou)隻(zhi)在(zai)檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)內(nei)抗(kang)原(yuan)表(biao)位(wei)的(de)時(shi)候(hou)才(cai)需(xu)要(yao)，因(yin)為(wei)抗(kang)體(ti)需(xu)要(yao)進(jin)入(ru)細(xi)胞(bao)內(nei)部(bu)去(qu)檢(jian)測(ce)蛋(dan)白(bai)。但(dan)是(shi)，如(ru)果(guo)待(dai)檢(jian)測(ce)的(de)是(shi)跨(kua)膜(mo)蛋(dan)白(bai)，且(qie)其(qi)抗(kang)原(yuan)表(biao)位(wei)處(chu)於(yu)胞(bao)質(zhi)內(nei)區(qu)域(yu)，則(ze)同(tong)樣(yang)需(xu)要(yao)對(dui)細(xi)胞(bao)進(jin)行(xing)通(tong)透(tou)。相(xiang)反(fan)，如(ru)果(guo)所(suo)檢(jian)測(ce)的(de)抗(kang)原(yuan)表(biao)位(wei)位(wei)於(yu)膜(mo)蛋(dan)白(bai)的(de)胞(bao)外(wai)段(duan)，則(ze)不(bu)需(xu)要(yao)進(jin)行(xing)通(tong)透(tou)。丙(bing)酮(tong)本(ben)身(shen)具(ju)有(you)通(tong)透(tou)作(zuo)用(yong)，因(yin)此(ci)用(yong)丙(bing)酮(tong)作(zuo)為(wei)固(gu)定(ding)劑(ji)時(shi)是(shi)不(bu)需(xu)要(yao)通(tong)透(tou)的(de)。甲(jia)醇(chun)同(tong)樣(yang)具(ju)有(you)通(tong)透(tou)作(zuo)用(yong)，但(dan)有(you)些(xie)場(chang)合(he)並(bing)不(bu)適(shi)合(he)用(yong)甲(jia)醇(chun)，因(yin)為(wei)一(yi)些(xie)表(biao)位(wei)對(dui)甲(jia)醇(chun)非(fei)常(chang)敏(min)感(gan)。常(chang)用(yong)的(de)通(tong)透(tou)劑(ji)是(shi)去(qu)垢(gou)劑(ji)，如(ru)Triton ,NP-40,以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40屬(shu)於(yu)烈(lie)性(xing)去(qu)垢(gou)劑(ji)，可(ke)部(bu)分(fen)溶(rong)解(jie)細(xi)胞(bao)核(he)膜(mo)，因(yin)此(ci)非(fei)常(chang)適(shi)合(he)核(he)抗(kang)原(yuan)檢(jian)測(ce)。但(dan)應(ying)該(gai)注(zhu)意(yi)的(de)是(shi)，如(ru)果(guo)在(zai)高(gao)濃(nong)度(du)下(xia)使(shi)用(yong)或(huo)者(zhe)作(zuo)用(yong)時(shi)間(jian)過(guo)長(chang)，它(ta)們(men)將(jiang)破(po)壞(huai)蛋(dan)白(bai)，從(cong)而(er)影(ying)響(xiang)實(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)。Triton X-100shizuichangyongdetongtouji，danshitajiangpohuaixibaomo，yincibushiyongyuxibaomoxiangguankangyuan。houmianyizuqugoujiyaowenhededuo，tamenkeyizaixibaozhimoshangxingchengzugoudadekongxiyiyunxukangtitongguo，danshibuhuirongjiexibaozhimo。shiyubaozhikangyuanhuozhezhimoshangkaojinbaozhiyimiandekangyuan，yeshiyukerongxingdehekangyuan。
一(yi)般(ban)的(de)操(cao)作(zuo)程(cheng)序(xu)是(shi)先(xian)固(gu)定(ding)後(hou)通(tong)透(tou)，但(dan)針(zhen)對(dui)有(you)些(xie)水(shui)不(bu)溶(rong)性(xing)的(de)目(mu)的(de)抗(kang)原(yuan)的(de)檢(jian)測(ce)宜(yi)先(xian)通(tong)透(tou)再(zai)固(gu)定(ding)，這(zhe)樣(yang)做(zuo)的(de)原(yuan)因(yin)主(zhu)要(yao)是(shi)可(ke)以(yi)通(tong)過(guo)通(tong)透(tou)去(qu)除(chu)許(xu)多(duo)水(shui)溶(rong)性(xing)的(de)蛋(dan)白(bai)，從(cong)而(er)大(da)大(da)減(jian)少(shao)了(le)免(mian)疫(yi)熒(ying)光(guang)的(de)背(bei)景(jing)和(he)非(fei)特(te)異(yi)性(xing)信(xin)號(hao)。固(gu)定(ding)後(hou)以(yi)冷(leng)PBS液漂洗，最後以蒸餾水衝洗，防止自發性熒光。
（三）封閉
封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結合，最常用的封閉劑為1% BSA, PBS pH 7.5,其他可選擇的封閉劑還有 1% gelatin, 1%bovine 或與二抗種屬相同的血清（3-10%）等。
（四）抗體孵育
zhijiemianyiyingguangfazhongdeyikanghejianjiemianyiyingguangfazhongdeerkangdoushiyingguangkangti，yincizaizhexiekangtifuyudeshihoubixuzhuyibiguang。ciwai，weibaozhengjiehezhilianghefangzhiganzao，kangtifuyuyingjinliangzaishihezhongjinxing。
（五）封片及熒光觀察
標(biao)記(ji)好(hao)熒(ying)光(guang)的(de)細(xi)胞(bao)片(pian)原(yuan)則(ze)上(shang)可(ke)以(yi)直(zhi)接(jie)進(jin)行(xing)觀(guan)察(cha)，特(te)別(bie)是(shi)有(you)時(shi)候(hou)封(feng)片(pian)不(bu)當(dang)反(fan)而(er)使(shi)得(de)前(qian)功(gong)盡(jin)棄(qi)。但(dan)在(zai)絕(jue)大(da)多(duo)數(shu)情(qing)況(kuang)下(xia)，為(wei)了(le)保(bao)存(cun)結(jie)果(guo)，以(yi)便(bian)進(jin)一(yi)步(bu)觀(guan)察(cha)、照像、統tong計ji分fen析xi等deng，需xu作zuo封feng片pian處chu理li。常chang規gui的de方fang法fa是shi采cai用yong甘gan油you或huo中zhong性xing樹shu脂zhi封feng片pian，為wei了le增zeng強qiang封feng片pian的de效xiao果guo，往wang往wang需xu要yao在zai封feng片pian時shi添tian加jia特te殊shu的de抗kang熒ying光guang淬cui滅mie劑ji。
（六）標本保存
由(you)於(yu)熒(ying)光(guang)色(se)素(su)和(he)蛋(dan)白(bai)質(zhi)分(fen)子(zi)的(de)穩(wen)定(ding)性(xing)都(dou)是(shi)相(xiang)對(dui)的(de)，因(yin)此(ci)隨(sui)著(zhe)保(bao)存(cun)時(shi)間(jian)的(de)延(yan)長(chang)，在(zai)各(ge)種(zhong)條(tiao)件(jian)影(ying)響(xiang)下(xia)，標(biao)記(ji)蛋(dan)白(bai)可(ke)能(neng)變(bian)性(xing)解(jie)離(li)，失(shi)去(qu)其(qi)應(ying)有(you)的(de)亮(liang)度(du)和(he)特(te)異(yi)性(xing)。因(yin)此(ci)給(gei)標(biao)本(ben)的(de) 保存帶來一定的困難，所以在標本進行熒光染色之後應立即觀察。由於性能良好的抗熒光淬滅劑的出現，熒光標記的標本可以在低溫（4℃或-20℃）下xia保bao存cun相xiang當dang長chang的de時shi間jian。在zai某mou些xie情qing形xing下xia，考kao慮lv到dao實shi驗yan的de成cheng本ben及ji實shi驗yan條tiao件jian，也ye可ke以yi采cai取qu權quan宜yi的de辦ban法fa，比bi如ru固gu定ding標biao本ben片pian後hou低di溫wen保bao存cun，在zai需xu要yao時shi再zai進jin行xing熒ying光guang標biao記ji，即ji隨sui用yong隨sui染ran。
