以內標法為例，選一與欲測組分相近但能完全分離的組分做內標物（當然是樣品中沒有的組分），然後配製欲測組分和內標物的混合標準溶液，進樣得相對校正因子。再將內標物加入欲測組分的樣品中，進樣後測得欲測組分和內標物的定量參數，用內標法公式計算即可。其(qi)實(shi)，從(cong)定(ding)義(yi)上(shang)來(lai)區(qu)分(fen)的(de)話(hua)，外(wai)標(biao)法(fa)就(jiu)是(shi)用(yong)標(biao)準(zhun)品(pin)的(de)峰(feng)麵(mian)積(ji)或(huo)峰(feng)高(gao)與(yu)其(qi)對(dui)應(ying)的(de)濃(nong)度(du)做(zuo)一(yi)條(tiao)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)，測(ce)出(chu)樣(yang)品(pin)的(de)峰(feng)麵(mian)積(ji)或(huo)峰(feng)高(gao)，在(zai)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)上(shang)查(zha)出(chu)其(qi)對(dui)應(ying)的(de)濃(nong)度(du)，這(zhe)是(shi)最(zui)常(chang)用(yong)的(de)一(yi)種(zhong)定(ding)量(liang)方(fang)法(fa)；內nei標biao法fa是shi對dui應ying外wai標biao法fa說shuo的de，內nei標biao法fa是shi將jiang一yi定ding量liang的de純chun物wu質zhi作zuo內nei標biao物wu，加jia入ru到dao準zhun確que稱cheng量liang的de試shi樣yang中zhong，根gen據ju被bei測ce試shi樣yang和he內nei標biao物wu的de質zhi量liang比bi及ji其qi相xiang應ying的de色se譜pu峰feng麵mian積ji之zhi比bi，來lai計ji算suan被bei測ce組zu分fen的de含han量liang。
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waibiaofaxuyaoyongyangpinhebiaozhunpinduibi，danshiyoushiwomenhennanbaozhengyangpinhebiaozhunpinjindetijishiyiyangde，bijingyaoyouwucha，zheshihoujiuyongneibiaofa，jiushizaiwaibiaofadejichushang，zaiyangpinhebiaozhunpinlizaijiaruyizhongwuzhi，tongguojiaruwuzhidefengmianjihuofenggaodebianhua，jiukeyikanchuwomenbiaozhunpinheyangpinjinyangtijidechabie，dantongshihuiyinjinjiaruwuzhidechengliangwucha。suoyiyibanyongwaibiaofalaidingliang，ruguojinyangtijihennanzhangwo，jiuyongneibiaofa，keyixiaochujinyangtijidewucha。
首先用欲測組分的標準樣品繪製標準工作曲線。具體作法是：yongbiaozhunyangpinpeizhichengbutongnongdudebiaozhunxilie，zaiyuyucezufenxiangtongdeseputiaojianxia，dengtijizhunqueliangjinyang，celianggefengdefengmianjihuofenggao，yongfengmianjihuofenggaoduiyangpinnongduhuizhibiaozhungongzuoquxian，cibiaozhungongzuoquxianyingshitongguoyuandiandezhixian。ruobiaozhungongzuoquxianbutongguoyuandian，shuomingcedingfangfacunzaixitongwucha。biaozhungongzuoquxiandexielvjiweijueduixiaozhengyinzi。
dangyucezufenhanliangbianhuabuda，bingyizhizheyizufendedagaihanliangshi，yekeyibubihuizhibiaozhungongzuoquxian，eryongdandianxiaozhengfa，jizhijiebijiaofadingliang。dandianxiaozhengfashijishangshiliyongyuandianzuoweibiaozhungongzuoquxianshangdelingyigedian。yinci，dangfangfacunzaixitongwuchashi（即標準工作曲線不通過原點），單點校正法的誤差較大。因此規定，y=ax+b， b的絕對值應不大於100%響應值是y的2%。標準曲線法的優點：繪(hui)製(zhi)好(hao)標(biao)準(zhun)工(gong)作(zuo)曲(qu)線(xian)後(hou)測(ce)定(ding)工(gong)作(zuo)就(jiu)很(hen)簡(jian)單(dan)了(le)，計(ji)算(suan)時(shi)可(ke)直(zhi)接(jie)從(cong)標(biao)準(zhun)工(gong)作(zuo)曲(qu)線(xian)上(shang)讀(du)出(chu)含(han)量(liang)，這(zhe)對(dui)大(da)量(liang)樣(yang)品(pin)分(fen)析(xi)十(shi)分(fen)合(he)適(shi)。特(te)別(bie)是(shi)標(biao)準(zhun)工(gong)作(zuo)曲(qu)線(xian)繪(hui)製(zhi)後(hou)可(ke)以(yi)使(shi)用(yong)一(yi)段(duan)時(shi)間(jian)，在(zai)此(ci)段(duan)時(shi)間(jian)內(nei)可(ke)經(jing)常(chang)用(yong)一(yi)個(ge)標(biao)準(zhun)樣(yang)品(pin)對(dui)標(biao)準(zhun)工(gong)作(zuo)曲(qu)線(xian)進(jin)行(xing)單(dan)點(dian)校(xiao)正(zheng)，以(yi)確(que)定(ding)該(gai)標(biao)準(zhun)工(gong)作(zuo)曲(qu)線(xian)是(shi)否(fou)還(hai)可(ke)使(shi)用(yong)。標準曲線法的缺點：每次樣品分析的色譜條件（檢測器的響應性能，柱溫度，流動相流速及組成，進樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現較大誤差。另外，標準工作曲線繪製時，一般使用欲測組分的標準樣品（或已知準確含量的樣品），因此對樣品前處理過程中欲測組分的變化無法進行補償。
選擇適宜的物質作為欲測組分的參比物，定量加到樣品中去，依據欲測組分和參比物在檢測器上的響應值（峰麵積或峰高）之比和參比物加入的量進行定量分析的方法稱為內標法。
內nei標biao法fa的de關guan鍵jian是shi選xuan擇ze合he適shi的de內nei標biao物wu。內nei標biao物wu應ying是shi原yuan樣yang品pin中zhong不bu存cun在zai的de純chun物wu質zhi，該gai物wu質zhi的de性xing質zhi應ying盡jin可ke能neng與yu欲yu測ce組zu分fen相xiang近jin，不bu與yu被bei測ce樣yang品pin起qi化hua學xue反fan應ying，同tong時shi要yao能neng完wan全quan溶rong於yu被bei測ce樣yang品pin中zhong。內nei標biao物wu的de峰feng應ying盡jin可ke能neng接jie近jin欲yu測ce組zu分fen的de峰feng，或huo位wei於yu幾ji個ge欲yu測ce組zu分fen的de峰feng中zhong間jian，但dan必bi須xu與yu樣yang品pin中zhong的de所suo有you峰feng不bu重zhong疊die，即ji完wan全quan分fen開kai。內標法的優點：進樣量的變化，色譜條件的微小變化對內標法定量結果的影響不大，特別是在樣品前處理（如濃縮、萃取，衍生化等）前qian加jia入ru內nei標biao物wu，然ran後hou再zai進jin行xing前qian處chu理li時shi，可ke部bu分fen補bu償chang欲yu測ce組zu分fen在zai樣yang品pin前qian處chu理li時shi的de損sun失shi。若ruo要yao獲huo得de很hen高gao精jing度du的de結jie果guo時shi，可ke以yi加jia入ru數shu種zhong內nei標biao物wu，以yi提ti高gao定ding量liang分fen析xi的de精jing度du。內標法的缺點：選擇合適的內標物比較困難，內標物的稱量要準確，操作較麻煩。使用內標法定量時要測量欲測組分和內標物的兩個峰的峰麵積（或峰高），根據誤差疊加原理，內標法定量的誤差中，由於峰麵積測量引起的誤差是標準曲線法定量的2-2shiyouyujinyangliangdebianhuaheseputiaojianbianhuayinqidewucha，neibiaofabibiaozhunquxianfayaoxiaohenduo，suoyizongdelaishuo，neibiaofadingliangbibiaozhunquxianfadingliangdezhunqueduhejingmidudouyaohao。
biaozhunjiarufashizhishangshiyizhongteshudeneibiaofa，shizaixuanzebudaoheshideneibiaowushi，yiyucezufendechunwuzhiweineibiaowu，jiarudaodaiceyangpinzhong，ranhouzaixiangtongdeseputiaojianxia，cedingjiaruyucezufenchunwuzhiqianhouyucezufendefengmianji（或峰高），從而計算欲測組分在樣品中的含量的方法。
標準加入法的優點：不(bu)需(xu)要(yao)另(ling)外(wai)的(de)標(biao)準(zhun)物(wu)質(zhi)作(zuo)內(nei)標(biao)物(wu)，隻(zhi)需(xu)欲(yu)測(ce)組(zu)分(fen)的(de)純(chun)物(wu)質(zhi)，進(jin)樣(yang)量(liang)不(bu)必(bi)十(shi)分(fen)準(zhun)確(que)，操(cao)作(zuo)簡(jian)單(dan)。若(ruo)在(zai)樣(yang)品(pin)的(de)前(qian)處(chu)理(li)之(zhi)前(qian)就(jiu)加(jia)入(ru)已(yi)知(zhi)準(zhun)確(que)量(liang)的(de)欲(yu)測(ce)組(zu)分(fen)，則(ze)可(ke)以(yi)完(wan)全(quan)補(bu)償(chang)欲(yu)測(ce)組(zu)分(fen)在(zai)前(qian)處(chu)理(li)過(guo)程(cheng)中(zhong)的(de)損(sun)失(shi)，是(shi)色(se)譜(pu)分(fen)析(xi)中(zhong)較(jiao)常(chang)用(yong)的(de)定(ding)量(liang)分(fen)析(xi)方(fang)法(fa)。標準加入法的缺點：要求加入欲測組分前後兩次色譜測定的色譜條件完全相同，以保證兩次測定時的校正因子完全相等，否則將引起分析測定的誤差。2、它必須完全溶於試樣中，並與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；4、色譜峰的位置應與被測組分的色譜峰的位置相近，或在幾個被測組分色譜峰中間。neibiaofadeyoudianshicedingdejieguojiaoweizhunque，youyutongguoceliangneibiaowujibeicezufendefengmianjidexiangduizhilaijinxingjisuande，yinerzaiyidingchengdushangxiaochulecaozuotiaojiandengdebianhuasuoyinqidewucha。neibiaofadequedianshicaozuochengxujiaoweimafan，meicifenxishineibiaowuheshiyangdouyaozhunquechengliang，youshixunzhaoheshideneibiaowuyeyoukunnan。外標法簡便，但進樣量要求十分準確，要嚴格控製在與標準物相同的操作條件下進行，否則造成分析誤差，得不到準確的測量結果。內(nei)標(biao)與(yu)外(wai)標(biao)都(dou)是(shi)定(ding)量(liang)的(de)一(yi)種(zhong)方(fang)法(fa)而(er)已(yi)，至(zhi)於(yu)哪(na)一(yi)種(zhong)方(fang)法(fa)好(hao)與(yu)不(bu)好(hao)不(bu)能(neng)一(yi)概(gai)而(er)論(lun)，做(zuo)不(bu)同(tong)的(de)分(fen)析(xi)，麵(mian)對(dui)著(zhe)不(bu)同(tong)的(de)要(yao)求(qiu)，再(zai)加(jia)上(shang)分(fen)析(xi)成(cheng)本(ben)分(fen)析(xi)效(xiao)率(lv)等(deng)等(deng)問(wen)題(ti)，我(wo)想(xiang)簡(jian)單(dan)而(er)有(you)效(xiao)進(jin)行(xing)定(ding)量(liang)分(fen)析(xi)來(lai)滿(man)足(zu)要(yao)求(qiu)才(cai)是(shi)最(zui)重(zhong)要(yao)的(de)。
zaixuduoyingyongzhong，neibiaoyingjinkenengzaoditianjiadaofenxiguochengzhong，liruyongyuxiaozhengyangpinzhibeiguochengzhongdesunshi。danzaimouxieyingyongzhong，kenengxuyaozaishaohoujieduantianjianeibiao。liru，duiyuyouxiaojiejieduandefangfa，ruguosuoxuandeneibiaoshixiaojiehoumubiaohuahewudeleisiwu，namezaixiaojiejieduanzhihoutianjiakenengshizuiheshide。xuanzefeitongweisubiaojideneibiaoshiyingkaolvyixiajigefangmian：
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任何要分析的樣品中都不應該含有這種物質。例如，使用處方藥作為治療藥物監測（TDM) 應用的內標就不是一個好主意。
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內標物的理化性質應盡可能與目標分析物相似，洗脫時間應盡可能接近目標分析物。
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同分異構體、同源物和結構類似物通常是理想的候選物質。
▲ 圖1. 內標使用示意圖【來源：Probing Protein Glycation by Chromatography and Mass Spectrometry: Analysis of Glycation Adducts】
同位素內標的使用
如果有同位素標記的內標，則應在分析開始時添加，以用於計算一些方法變量，包括：
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轉移和淨化階段的損失。
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提取效率的變化。
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進樣量的變化。
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基質抑製/增強。
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樣品和校準品之間響應的變化
在使用同位素標記的內標時需要謹慎。如果有多種同位素可供選擇，在 LC-MS 應用中，13C 和 15N 標記的化合物通常比氘（2H）標記的化合物更受歡迎。這是因為與 13C 和 15N neibiaoxiangbi，daobiaojihuahewudesepubaoliushijianyutianranhuahewudesepubaoliushijianyoujiaodapianyi。zaiyexiangsepuyingyongzhong，yugaoxiaoqixiangsepufenlixiangbi，zhezhongbaoliushijiandepianyitongchanghenxiao，danmubiaohuahewuheneibiaozaijizhiyizhi（和增強）方麵仍有可能存在細微差別，進而影響測量的峰麵積。
在選擇同位素標記的內標時，還應考慮以下幾點：
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biaojiyingzaifenzidewendingbufen，biaojichengdubuyingyinfenxiguochengzhongfashengdefanxiangjiaohuanergaibian。kenenghuifashengyixiangbudaodejiaohuan，lirutongguotongfenyigoujizhifashengdejiaohuan，yincizaishiyanzhongyingshizhongduizhefangmianjinxingjianzha。
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目標分析物和內標之間不應有任何明顯的質譜重疊。因此，在大多數小分子應用中，內標的單同位素質量最好至少比天然化合物高 3 Da。
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還應避免同位素峰中含有大量未標記物質。內標的總體純度並不重要，隻要其雜質不影響分析方法中的任何目標化合物即可。
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在 IDMS 方法中，內標和目標物的完全平衡對確保準確性至關重要。可能需要進行平衡和萃取研究，以證明目標物已被完全萃取/釋放而未發生降解，或者內標已與樣品平衡，並與基質成分和/或活性表麵結合到與目標物相同的程度。
若在儀器上使用內標法進行定量，則橫坐標為：目標物濃度與內標濃度的比值；縱坐標為目標物峰麵積與內標峰麵積的比值（外標法的橫坐標為目標物濃度，縱坐標為目標物峰麵積）。
以前做過很多醫藥、農nong藥yao中zhong間jian體ti的de芳fang香xiang族zu鹵lu代dai化hua合he物wu的de常chang量liang定ding量liang分fen析xi，沒mei有you自zi動dong進jin樣yang器qi，用yong外wai標biao法fa定ding量liang，確que實shi重zhong現xian性xing與yu穩wen定ding性xing非fei常chang差cha，結jie果guo經jing常chang受shou到dao搞gao合he成cheng同tong事shi的de質zhi疑yi。其qi實shi，仔zai細xi分fen析xi原yuan因yin不bu一yi定ding就jiu是shi外wai標biao法fa不bu適shi合he這zhe種zhong定ding量liang分fen析xi，首shou先xian我wo們men的de實shi驗yan室shi儀yi器qi和he手shou段duan是shi否fou調tiao整zheng到dao一yi種zhong穩wen定ding而er合he理li的de狀zhuang態tai了le，比bi如ru，襯chen管guan是shi否fou潔jie淨jing，玻bo璃li棉mian的de位wei置zhi是shi否fou合he適shi恰qia當dang（能否使樣品盡可能的汽化）、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對稱（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配）、附近有沒有其它色譜峰的幹擾、選用什麼進樣方式（如快速進樣還是熱針進樣）等等因素的影響都需要考慮，如果這些因素都考慮了，按照GMP方法驗證對於精密度的要求，同一樣品進6針以上的RSD和配製6個樣品的定量結果RSD都能滿足小於1.5%的(de)要(yao)求(qiu)，那(na)麼(me)這(zhe)個(ge)方(fang)法(fa)用(yong)外(wai)標(biao)法(fa)就(jiu)是(shi)完(wan)全(quan)適(shi)用(yong)的(de)，但(dan)是(shi)前(qian)麵(mian)的(de)影(ying)響(xiang)因(yin)素(su)是(shi)一(yi)定(ding)要(yao)都(dou)考(kao)慮(lv)到(dao)的(de)，否(fou)則(ze)談(tan)論(lun)這(zhe)個(ge)方(fang)法(fa)是(shi)否(fou)適(shi)用(yong)就(jiu)有(you)失(shi)偏(pian)頗(po)了(le)。在做過的許多出口產品的定量分析方法當中有許多是一些醫藥公司提供的比較完善而驗證過的方法，內標與外標都有（他們用的都是自動進樣）精密度都能滿足RSD小於1.5%的(de)要(yao)求(qiu)，當(dang)一(yi)個(ge)方(fang)法(fa)能(neng)夠(gou)滿(man)足(zu)測(ce)試(shi)要(yao)求(qiu)的(de)時(shi)候(hou)，無(wu)論(lun)內(nei)標(biao)外(wai)標(biao)，都(dou)是(shi)可(ke)行(xing)的(de)，當(dang)然(ran)有(you)一(yi)個(ge)分(fen)析(xi)成(cheng)本(ben)和(he)分(fen)析(xi)時(shi)間(jian)的(de)問(wen)題(ti)，內(nei)標(biao)的(de)成(cheng)本(ben)和(he)控(kong)製(zhi)溶(rong)液(ye)、樣yang品pin溶rong液ye的de配pei製zhi當dang然ran要yao比bi外wai標biao要yao高gao和he麻ma煩fan一yi些xie了le。而er有you些xie時shi候hou，可ke能neng受shou你ni實shi驗yan室shi現xian有you儀yi器qi和he附fu屬shu設she備bei的de影ying響xiang，達da不bu到dao一yi定ding的de要yao求qiu，而er還hai必bi須xu進jin行xing定ding量liang分fen析xi，有you時shi外wai標biao的de結jie果guo可ke能neng就jiu要yao差cha一yi些xie，這zhe時shi，你ni可ke能neng就jiu要yao考kao慮lv用yong內nei標biao法fa了le，可ke以yi排pai除chu手shou動dong進jin樣yang的de誤wu差cha、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時內標可能就顯示出它的優勢來了。上麵已經提到當做方法驗證的時候，當同一樣品配製6個樣品溶液用所選用的外標法進行定量的時候，RSD都滿足1.5%的要求時，也分為兩種情況，小於1%和大於1%小於1.5%。如果RSD的結果小於1%，那這個方法就沒有什麼可以懷疑的了；如果RSD的結果大於1%而在1.5%略低一些的範圍活動時，這個方法的可行性就將受到質疑，畢竟這是方法驗證，你就要考慮上麵1所提到的影響因素的影響了，如果排除掉以上的影響因素，RSD還是在1.5%附近，就要嚐試內標了，如果內標結果的RSD很好，就證明你的這個方法受實驗條件的影響很大，隻能用內標了，或者幹脆將原方法做大的變動，再嚐試用外標法測試。而對於微量分析，比如農藥和獸藥殘留的分析、環境分析等，根據不同的限量標準要求對於精密度的要求也比常量分析的要求要寬鬆的多，RSD有時可以允許達到10%甚至更高，這時可能外標法有更大的應用空間。單dan從cong精jing密mi度du方fang麵mian去qu考kao慮lv，排pai除chu其qi它ta成cheng本ben和he效xiao率lv的de因yin素su，個ge人ren認ren為wei還hai是shi內nei標biao優you於yu外wai標biao。曾zeng經jing做zuo過guo一yi個ge中zhong間jian體ti二er氨an基ji丙bing醇chun的de常chang量liang定ding量liang分fen析xi，以yi二乙醇胺為內標，RTX-5amine（堿改性）15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析，將配製好的控製溶液（含有內標物）自動進樣器進6針，目的物（二氨基丙醇）與內標物（二乙醇胺）峰麵積比率的RSD為0.18%，而隻對這六針樣品的目的物峰（二氨基丙醇）麵積求RSD，結果為0.71%，通tong過guo這zhe一yi實shi例li的de結jie果guo大da家jia就jiu會hui發fa現xian到dao底di哪na個ge方fang法fa精jing密mi度du更geng好hao了le，當dang然ran是shi內nei標biao更geng好hao了le。當dang然ran這zhe個ge化hua合he物wu的de檢jian測ce方fang法fa最zui後hou根gen據ju上shang麵mian的de驗yan證zheng數shu據ju用yong內nei標biao和he外wai標biao定ding量liang都dou是shi可ke以yi的de，實shi驗yan室shi可ke以yi自zi由you選xuan擇ze。但dan內nei標biao與yu外wai標biao精jing密mi度du結jie果guo的de差cha異yi是shi顯xian然ran存cun在zai的de事shi實shi。綜上所述，如果應用外標法能夠滿足要求的話，當然首選還是外標法，畢竟簡單而省事。對於精密度要求比較高、結果準確度會產生重大影響、實(shi)驗(yan)室(shi)條(tiao)件(jian)不(bu)是(shi)很(hen)理(li)想(xiang)的(de)等(deng)等(deng)條(tiao)件(jian)下(xia)，用(yong)內(nei)標(biao)法(fa)還(hai)是(shi)必(bi)要(yao)的(de)。但(dan)無(wu)論(lun)應(ying)用(yong)那(na)種(zhong)方(fang)法(fa)，方(fang)法(fa)的(de)驗(yan)證(zheng)和(he)確(que)認(ren)都(dou)是(shi)很(hen)重(zhong)要(yao)的(de)，隻(zhi)要(yao)是(shi)按(an)照(zhao)程(cheng)序(xu)經(jing)過(guo)驗(yan)證(zheng)和(he)確(que)認(ren)的(de)方(fang)法(fa)，都(dou)有(you)其(qi)應(ying)用(yong)的(de)空(kong)間(jian)的(de)。個(ge)人(ren)觀(guan)點(dian)，供(gong)大(da)家(jia)參(can)考(kao)。
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