革蘭氏染色的原理：

細菌細胞通過結晶紫初染和碘液媒染後，在細胞壁內形成了不溶於水的結晶紫與碘的複合物，革蘭氏陽性菌由於其細胞壁較厚、肽tai聚ju糖tang網wang層ceng次ci較jiao多duo且qie交jiao聯lian致zhi密mi，故gu遇yu乙yi醇chun或huo丙bing酮tong脫tuo色se處chu理li時shi，因yin失shi水shui反fan而er使shi網wang孔kong縮suo小xiao
，再zai加jia上shang它ta不bu含han類lei脂zhi，故gu乙yi醇chun處chu理li不bu會hui出chu現xian縫feng隙xi，因yin此ci能neng把ba結jie晶jing紫zi與yu碘dian複fu合he物wu牢lao牢lao留liu在zai壁bi內nei，使shi其qi仍reng呈cheng紫zi色se；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高
、taijutangcengboqiejiaolianducha，zaiyutuosejihou，yileizhiweizhudewaimoxunsurongjie，boersongsandetaijutangwangbunengzudangjiejingziyudianfuhewuderongchu
，yincitongguoyichuntuosehourengchengwuse，zaijingshahuangdenghongseranliaofuran，jiushigelanshiyinxingjunchenghongse。

革蘭氏染色的步驟：

塗片、晾幹、固定
、染色
、水洗
、媒染、脫色、複染。此處不加贅述。

影響革蘭氏染色結果準確性的關鍵因素：

1.試劑影響。這是我們首先應該確保的，我們使用的試劑必須是有效的。實驗室應當建立有效的試劑管理程序
，從試劑的驗收到存放

、使用、過期後的廢棄處理都應有嚴格規定，確保我們使用的試劑是有效的。工欲善其事必先利其器
，這也是我們試驗成功最基礎的一環。

2.染色菌的選擇。菌齡對革蘭氏染色結果的影響是十分大的。我(wo)們(men)染(ran)色(se)過(guo)程(cheng)中(zhong)選(xuan)擇(ze)的(de)菌(jun)應(ying)該(gai)是(shi)處(chu)於(yu)活(huo)躍(yue)生(sheng)長(chang)期(qi)，這(zhe)樣(yang)的(de)細(xi)菌(jun)活(huo)性(xing)強(qiang)
，生(sheng)理(li)特(te)征(zheng)明(ming)顯(xian)，所(suo)以(yi)染(ran)色(se)的(de)結(jie)果(guo)準(zhun)確(que)度(du)高(gao)
，一(yi)般(ban)情(qing)況(kuang)下(xia)不(bu)會(hui)出(chu)現(xian)誤(wu)差(cha)。培(pei)養(yang)時(shi)間(jian)較(jiao)長(chang)的(de)革(ge)蘭(lan)氏(shi)陽(yang)性(xing)菌(jun)

，由(you)於(yu)細(xi)胞(bao)老(lao)化(hua)，甚(shen)至(zhi)有(you)部(bu)分(fen)菌(jun)在(zai)染(ran)色(se)之(zhi)前(qian)就(jiu)已(yi)經(jing)死(si)亡(wang)或(huo)者(zhe)自(zi)行(xing)溶(rong)解(jie)了(le)
，造(zao)成(cheng)細(xi)胞(bao)壁(bi)通(tong)透(tou)性(xing)增(zeng)加(jia)，就(jiu)會(hui)呈(cheng)現(xian)出(chu)假(jia)陰(yin)性(xing)。以yi金jin黃huang色se葡pu萄tao球qiu菌jun為wei例li，金jin葡pu是shi典dian型xing的de革ge蘭lan氏shi陽yang性xing菌jun

，有you人ren曾zeng經jing統tong計ji過guo培pei養yang至zhi不bu同tong時shi間jian的de金jin葡pu的de革ge蘭lan氏shi染ran色se結jie果guo，結jie果guo表biao明ming
，在zai金jin葡pu活huo躍yue期qi的de22h-26h之間
，染色結果的準確率基本可以達到100%，而超過26h之後
，準確率就開始下降
，培養至36h時，準確率大概會下降30%左右。所以我們在染色時，一定要選擇處於活躍期
、活性較強的菌落，在檢測過程中一定要嚴格的在國標要求的時間段內進行染色試驗，不能提前或者延後。

3.塗菌的狀態。在(zai)染(ran)色(se)最(zui)初(chu)的(de)塗(tu)布(bu)中(zhong)，在(zai)挑(tiao)取(qu)菌(jun)體(ti)後(hou)應(ying)該(gai)在(zai)無(wu)菌(jun)水(shui)上(shang)塗(tu)成(cheng)薄(bo)薄(bo)的(de)菌(jun)膜(mo)。而(er)在(zai)塗(tu)布(bu)過(guo)程(cheng)中(zhong)
，若(ruo)是(shi)菌(jun)體(ti)堆(dui)積(ji)
，也(ye)會(hui)極(ji)大(da)影(ying)響(xiang)染(ran)色(se)結(jie)果(guo)的(de)準(zhun)確(que)性(xing)。菌落堆積過多，往往菌體之間變得毫無縫隙，而其細胞壁的成分影響造成了脫色的情況不佳

，容易產生假陽性的結果。同時，在初染、媒(mei)染(ran)及(ji)複(fu)染(ran)的(de)過(guo)程(cheng)中(zhong)
，應(ying)將(jiang)染(ran)液(ye)覆(fu)蓋(gai)整(zheng)個(ge)菌(jun)膜(mo)
，避(bi)免(mian)一(yi)部(bu)分(fen)菌(jun)染(ran)色(se)而(er)另(ling)一(yi)部(bu)分(fen)菌(jun)沒(mei)有(you)染(ran)色(se)。因(yin)此(ci)在(zai)塗(tu)片(pian)過(guo)程(cheng)一(yi)定(ding)要(yao)將(jiang)菌(jun)膜(mo)塗(tu)得(de)少(shao)而(er)均(jun)勻(yun)，這(zhe)樣(yang)才(cai)能(neng)達(da)到(dao)最(zui)佳(jia)效(xiao)果(guo)。

4.媒染時間。媒染時間對革蘭氏陰性菌的染色結果有很大影響。由you於yu媒mei染ran時shi間jian過guo長chang，結jie晶jing紫zi在zai碘dian液ye長chang時shi間jian作zuo用yong下xia過guo分fen牢lao固gu結jie合he在zai菌jun體ti細xi胞bao壁bi上shang，影ying響xiang了le酒jiu精jing的de脫tuo色se效xiao果guo，從cong而er會hui導dao致zhi這zhe種zhong假jia陽yang性xing的de效xiao果guo。以典型的革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌為例，有人做過統計，媒染時間嚴格控製在40s-60s之內，染色結果準確率基本可達到100%
，而超過60s準確率會有一定的降低，若媒染超過100s，準確率甚至可降低接近20%左右。因此在媒染過程中一定要注意媒染時間，控製在50-60s為宜。

5.酒精脫色。酒(jiu)精(jing)脫(tuo)色(se)也(ye)是(shi)一(yi)個(ge)對(dui)結(jie)果(guo)影(ying)響(xiang)較(jiao)大(da)的(de)操(cao)作(zuo)過(guo)程(cheng)。革(ge)蘭(lan)氏(shi)陰(yin)性(xing)菌(jun)和(he)革(ge)蘭(lan)氏(shi)陽(yang)性(xing)菌(jun)最(zui)主(zhu)要(yao)的(de)差(cha)異(yi)是(shi)細(xi)胞(bao)壁(bi)肽(tai)聚(ju)糖(tang)層(ceng)厚(hou)度(du)和(he)結(jie)構(gou)，革(ge)蘭(lan)氏(shi)陰(yin)性(xing)菌(jun)細(xi)胞(bao)壁(bi)肽(tai)聚(ju)糖(tang)層(ceng)很(hen)薄(bo)，脂(zhi)多(duo)糖(tang)含(han)量(liang)高(gao)因(yin)此(ci)在(zai)酒(jiu)精(jing)脫(tuo)色(se)時(shi)，細(xi)菌(jun)細(xi)胞(bao)壁(bi)的(de)多(duo)糖(tang)成(cheng)分(fen)會(hui)被(bei)酒(jiu)精(jing)溶(rong)解(jie)，增(zeng)大(da)了(le)細(xi)胞(bao)壁(bi)的(de)通(tong)透(tou)性(xing)

，結(jie)晶(jing)紫(zi)及(ji)碘(dian)複(fu)合(he)物(wu)就(jiu)很(hen)快(kuai)被(bei)酒(jiu)精(jing)洗(xi)脫(tuo)
，之(zhi)後(hou)就(jiu)會(hui)被(bei)沙(sha)黃(huang)複(fu)染(ran)呈(cheng)紅(hong)色(se)；而陽性菌肽聚糖層厚
，脂多糖少
，酒精隻能起到脫水效果而無法進入，這樣結晶紫和複合物就無法洗脫出來使細胞呈紫色。因(yin)此(ci)，酒(jiu)精(jing)脫(tuo)色(se)時(shi)間(jian)短(duan)，脫(tuo)色(se)效(xiao)果(guo)不(bu)佳(jia)，會(hui)導(dao)致(zhi)陰(yin)性(xing)菌(jun)菌(jun)體(ti)內(nei)的(de)結(jie)晶(jing)紫(zi)和(he)複(fu)合(he)物(wu)不(bu)能(neng)有(you)效(xiao)的(de)全(quan)部(bu)洗(xi)脫(tuo)出(chu)來(lai)
，就(jiu)會(hui)出(chu)現(xian)明(ming)顯(xian)的(de)誤(wu)差(cha)，使(shi)陰(yin)性(xing)菌(jun)出(chu)現(xian)假(jia)陽(yang)性(xing)。而(er)洗(xi)脫(tuo)時(shi)間(jian)過(guo)長(chang)，也(ye)會(hui)導(dao)致(zhi)陽(yang)性(xing)菌(jun)的(de)細(xi)胞(bao)壁(bi)被(bei)酒(jiu)精(jing)破(po)壞(huai)，導(dao)致(zhi)細(xi)胞(bao)內(nei)的(de)紫(zi)色(se)被(bei)洗(xi)脫(tuo)
，呈(cheng)現(xian)假(jia)陰(yin)性(xing)。因(yin)此(ci)洗(xi)脫(tuo)時(shi)間(jian)也(ye)是(shi)革(ge)蘭(lan)氏(shi)染(ran)色(se)的(de)關(guan)鍵(jian)環(huan)節(jie)。洗(xi)脫(tuo)時(shi)間(jian)應(ying)當(dang)嚴(yan)格(ge)控(kong)製(zhi)在(zai)20s-30s之間
，同時保證洗脫效果。

總結一下，在整個革蘭氏染色過程中，在保證試劑有效的前提下
，需要嚴格控製的幾個方麵：染色菌必須是在其活躍期內，塗布狀態不可太厚
，媒染時間嚴格控製在50s-60s之間，脫色時間嚴格控製在20s-30s。把握以上的關鍵控製點，革蘭氏染色基本就不會出現問題啦！