由於影響因素過多，細胞/組織培養中出現的一些問題往往很難分析並得到解決，因此被人戲稱為“黑色藝術”或“巫術”。本文列舉了一些動物細胞/組織培養中常見的問題及解決方法。
 
1.培養試劑的保存：
血清：-5oC - -20oC 保存，避免反複凍融。
培養基:  2oC – 8oC避光保存。
完全培養基: 2oC – 8oC避光保存，並在2周內用完。
盡量縮短血清和培養基見光的時間 
 
2.液體培養基中穀氨酰胺使用方法：
很多細胞生長要求在培養液中添加穀氨酰胺。穀氨酰胺在溶液中很不穩定，應置於-20◦C冰凍保存，用前加入培養基中。加有穀氨酰胺的液體培養基4◦C 冰箱儲存兩周以上時
，應重新加入原來量的穀氨酰胺。另一種選擇是使用L-穀氨酰胺的衍生物 - L-alanyl-L-glutamine dipeptide（如啟維益成公司代理的GenDepot的產品Glutaplex配方中含有的成分之一） 替代L-穀氨酰胺。Glutaplex與L-穀氨酰胺相比更加穩定，降解比較慢，提高細胞的存活和生長，極大降低對細胞有毒性的氨的積累。
 
3.培養基中是否應加酚紅：
酚紅在培養基中被用來作為pH值(zhi)的(de)指(zhi)示(shi)劑(ji)，中(zhong)性(xing)時(shi)為(wei)紅(hong)色(se)
，酸(suan)性(xing)時(shi)為(wei)黃(huang)色(se)
，堿(jian)性(xing)時(shi)紫(zi)色(se)。研(yan)究(jiu)表(biao)明(ming)
，酚(fen)紅(hong)可(ke)以(yi)模(mo)擬(ni)固(gu)醇(chun)類(lei)激(ji)素(su)的(de)作(zuo)用(yong)，特(te)別(bie)是(shi)雌(ci)激(ji)素(su)。為(wei)避(bi)免(mian)固(gu)醇(chun)類(lei)反(fan)應(ying)，培(pei)養(yang)細(xi)胞(bao)尤(you)其(qi)是(shi)哺(bu)乳(ru)類(lei)細(xi)胞(bao)時(shi)，應(ying)使(shi)用(yong)不(bu)加(jia)酚(fen)紅(hong)的(de)培(pei)養(yang)基(ji)。由(you)於(yu)酚(fen)紅(hong)幹(gan)擾(rao)檢(jian)測(ce)，一(yi)些(xie)研(yan)究(jiu)人(ren)員(yuan)在(zai)做(zuo)流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)檢(jian)測(ce)時(shi)不(bu)使(shi)用(yong)加(jia)酚(fen)紅(hong)的(de)培(pei)養(yang)基(ji)。

4.使用血清應注意的問題：
1）血清第一次使用前，是否應在56oC，30分鍾加熱血清以滅活補體係統
？
激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養ES細胞
、kunchongxibaohepinghuajixibaoshi，tuijianshiyongremiehuoxueqing。shiyanxianshi，jingguozhengquechulideremiehuoxueqingduidaduoshudexibaoeryanshibuxuyaode。jingcichuliguodexueqingduixibaoshengchangzhiyouweixiaodecujinhuowanquanmeiyourenhezuoyong
，shenzhitongchangyinweigaowenchuliyingxianglexueqingdezhiliang

，erzaochengxibaoshengchangsulvjiangdi。erjingguorechulidexueqingchendianwudexingchenghuixianzhudezengduo
，zhexiechendianwuzaidaozhixianweijingxiaguanchaxiangshi“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受汙染。而把血清放在37℃環(huan)境(jing)中(zhong)又(you)會(hui)使(shi)此(ci)沉(chen)澱(dian)物(wu)更(geng)增(zeng)多(duo)，使(shi)研(yan)究(jiu)者(zhe)誤(wu)認(ren)為(wei)是(shi)微(wei)生(sheng)物(wu)的(de)分(fen)裂(lie)擴(kuo)增(zeng)。若(ruo)非(fei)必(bi)須(xu)，可(ke)以(yi)不(bu)需(xu)要(yao)做(zuo)熱(re)處(chu)理(li)這(zhe)一(yi)步(bu)。不(bu)但(dan)節(jie)省(sheng)時(shi)間(jian)
，更(geng)確(que)保(bao)血(xue)清(qing)的(de)質(zhi)量(liang)。
 
2）通常使用的血清的種類：
新生牛血清：新出生牛5天內取血製成。小牛血清：小牛出生16周以內采血製成。胎牛血清：（進口血清）要求剖腹取胎製成。國內廠家往往不能做到
，經常把出生2天以內采血稱為胎牛血清。根據血清的生產工藝及血紅蛋白
、內毒素含量又分為：（1）特級胎牛血清：40納米過濾，內毒素含量≤10EU，   血紅蛋白含量≤10mg/dl。（2）優等胎牛血清：經過3次100納米過濾
，內毒素含量≤25EU/ml，血紅蛋白含量≤25mg/ml。（3）標準胎牛血清：3次100納米過濾，低內毒素

，低血紅蛋白含量。
 
3）為什麼儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉澱?  
有些胎牛血清產品沒有預老化
，儲存在2-8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白
，如冷凝集素
、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等可能聚集而形成沉澱或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。建議在-20℃儲存胎牛血清，避免反複凍融。
 
4）血清解凍後發現有絮狀沉澱物出現： 
血清中沉澱物的出現有許多種原因，但最普遍的原因是由於血清中脂蛋白的變性所造成。而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)zaixueqingjiedonghouyehuicunzaiyuxueqingzhong，yeshizaochengchendianwudeyuanyinzhiyi。danzhexiexuzhuangchendianwubingbuyingxiangxueqingbenshendezhiliang。ruoyuquchuzhexiexuzhuangchendianwu

，keyijiangxueqingfenzhuangzhiwujunlixinguannei，yi400g稍微離心，上清液即可接著加入培養基內一起過濾。最好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉澱物

，因為它可能會阻塞過濾膜。
 
5）如何避免沉澱物的產生?  
我們建議您在使用血清的時候

，注意下列的操作: (1)解凍血清時
，請按照所建議的逐步解凍法(-2℃至4℃過夜，37oC水浴解凍)。若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)
，非常容易產生沉澱物。(2)解凍血清時要隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉澱的發生。(3)請勿將血清置於37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁
，同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害

，而影響血清的質量。(4)如果在高於40oC的水浴中融化並且不時常搖晃混勻




，非常容易造成沉澱物增多。同樣血清的熱滅活也造成沉澱增多，若非必要

，可以省去熱滅活。(5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鍾的原則，並且隨時搖晃均勻。溫度過高
，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉澱物的增多。 
 
5.培養用液pH對細胞生長的影響：
由於，大多數細胞培養適宜的pH為7.2-7.4，偏離此範圍對細胞將產生有害的影響。各種細胞對pH的要求也不完全相同，原代培養細胞一般對pH變(bian)動(dong)耐(nai)受(shou)力(li)差(cha)，無(wu)限(xian)細(xi)胞(bao)係(xi)耐(nai)受(shou)力(li)強(qiang)。但(dan)總(zong)體(ti)來(lai)說(shuo)，細(xi)胞(bao)耐(nai)酸(suan)性(xing)比(bi)耐(nai)堿(jian)性(xing)強(qiang)一(yi)些(xie)，偏(pian)酸(suan)環(huan)境(jing)中(zhong)更(geng)利(li)於(yu)細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)。因(yin)此(ci)，我(wo)們(men)在(zai)配(pei)製(zhi)培(pei)養(yang)用(yong)液(ye)時(shi)，可(ke)把(ba)液(ye)體(ti)的(de)pH稍微調得偏酸一些。液體在經過0.10um或0.22um濾膜過濾時
，溶液的pH還會向上浮動0.2左右。
 
6.培養基pH變化迅速：
培養箱中CO2濃度不正確。碳酸氫鈉在培養液中濃度範圍為2.0 – 3.7g/L時，CO2的濃度範圍應分別為5% - 10%。
 
7.使用培養基時應注意的問題：  
培養基在使用前需37oC預熱。 細xi胞bao培pei養yang過guo程cheng中zhong，吸xi取qu過guo培pei養yang液ye的de吸xi管guan不bu能neng再zai用yong火huo焰yan燒shao灼zhuo
，防fang止zhi殘can留liu在zai吸xi管guan內nei的de培pei養yang基ji焦jiao化hua
，將jiang有you害hai物wu質zhi帶dai入ru培pei養yang液ye中zhong。盡jin量liang縮suo短duan各ge種zhong液ye體ti、細胞的暴露時間，減少汙染機會。避免液體間、細胞間的交叉汙染。配製完全培養基時，配製的量最好在2周內用完為好。
 
 
8.細胞傳代消化時胰蛋白酶的使用問題：
培養細胞胰蛋白酶溶液的消化能力和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg+離子和血清等因素有關。通常情況下，pH 8.0 , 溫度 37 oC 其作用能力最強。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。每次進行傳代消化前，一定要用無鈣鎂離子的PBS液或D-Hanks液反複衝洗細胞培養瓶，以便將含血清的培養基衝洗幹淨，這樣可大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為：   （1）０.０５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ
；   （2）０.２５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ。多數細胞傳代消化可使用０.０５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ這種消化液。

第一次開瓶後應立即少量分裝於無菌管中
，保存於–20℃，避免反複凍融造成胰蛋白酶活性降低
，並可減少汙染的機會。

注意：如果選用無血清培養基（如啟維益成公司代理的TNC Bio公司生產的產品 - 完全無動物成分的血清替代品XerumFreeTM與其他培養基混合配製的無血清培養基）

，在細胞傳代時
，不可使用胰蛋白酶消化
，因為胰蛋白酶在無血清時可去除細胞膜表麵的受體，這種情況應使用AccutaseTM消化。
 
9.貼壁細胞在用蛋白酶消化時不易分離：
1）培養液中存在酶的抑製劑

，可使用無鈣鎂離子的37oC預熱的Dulbecco’s PBS或胰酶-EDTA洗一遍，再消化 
2）胰酶濃度太低，使用更高濃度的胰酶
，更高濃度的EDTA或不同的酶消化，37oC消化以提高酶活性
3）細胞處於鋪滿狀態時間太長，形成細胞間的緊密連接
，以後注意在細胞鋪滿之前進行繼代培養。
 
10.細胞分離後形成團塊：
1) 細胞分散過程太過分，如用力吹吸、酶濃度過高、消化時間過長或溫度過高，酶溶液有毒性（如緩衝液pH或滲透壓不正確等）以至基因組DNA從破裂的細胞中釋放出來。解決方法是在細胞懸液中加入1滴無菌的1mg/ml溶於水中的DNA酶。
2)去除上清時，細胞離心的強度太大或時間太長

，應使用125g, 10分鍾輕微離心。
 
11.懸浮細胞形成團塊：
1）培養液中含有鈣鎂離子
2）支原體汙染 
3）由於過度消化造成細胞裂解
，釋放出基因組DNA
 
12.細胞不貼壁：
1）消化時間過長
，細胞膜上的貼壁蛋白被去除了
2）培養基中的血清或貼壁因子（常見於無血清培養基）不足
，可在培養基中加入貼壁因子或使用膠原蛋白、多聚L賴氨酸、纖連蛋白等包被的培養瓶。
3）支原體汙染
 
13.離心動物細胞的離心速率：?  
回收動物細胞
，離心速率一般為300g
，5 - 10 分鍾，離心強度過大將造成細胞破裂死亡。
 
14.細胞生長緩慢：
1）換用了不同的培養基或血清
，解決方法是可比較不同培養基成分
，用生長實驗比較以前批次和新批次的血清
， 提高接種細胞數，使細胞逐步適應新的培養基 。
2）L-穀氨酸等促進細胞生長的成分沒加入，用盡或分解了。用L-alanyl-L-glutamine dipeptide（如啟維益成公司代理的GenDepot的產品Glutaplex）替代L-穀氨酸 
3）支原體汙染或低水平細菌或真菌汙染
4）培養試劑保存不當
5）接種細胞數太少
6）細胞傳代次數太多
7）細胞傳代時密度太高，應在細胞鋪滿前的指數生長期傳代
 
15.細胞死亡：
1）培養箱中無CO2，檢查管子有無泄漏，是否需更換CO2罐，盡量減少開關培養箱的次數 
2）培養箱溫度不恒定
3）抗真菌劑或抗生素濃度過高，對細胞產生毒性
4）細胞在凍存或解凍過程中被破壞
5）培養基中滲透壓不正確
6）培養基中積累了有毒的代謝產物
 
16.細胞冷凍培養基的成份：
動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 %原來細胞生長用的新鮮培養基均勻混合。注意：由於DMSO 稀釋時會放出大量熱能，所以不可將DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配製完成。
 
17.DMSO的等級及使用和保存：
   冷凍保存使用之DMSO 等級必須為Tissue culture grade的DMSO (如Sigma D2650)。其本身即為無菌狀況，第一次開瓶後應立即少量分裝於無菌試管中，保存於4°C。避免反複凍融造成DMSO 裂解而釋出有害物質，並可減少汙染的機會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO 的Nylon 材質濾膜。
 
18.凍存液中的甘油的保存：
要避光保存，見光後甘油轉化為對細胞有毒性的丙烯醛。
 
19.細胞欲冷凍保存時注意事項：?
冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml
，融合瘤細胞則以5x106 cells/ml為宜。實際操作時
，建議按照細胞生產商建議的細胞密度凍存。凍存傳代次數低的細胞。
 
20.冷凍保存細胞之方法：?   
冷凍保存方法一: 冷凍管置於4℃ 30-60 分鍾→ （-20℃ 30 分鍾）→ -80℃16-18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase長期儲存
，如細胞浸在液氮中，有可能被液氮中的微生物汙染。   
冷凍保存方法二: 冷凍管置於已設定程序的可程序降溫機中每分鍾降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下，再放入液氮槽vapor phase長期儲存。-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡。也可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，但存活率降低。
 
21.細胞解凍：
快速解凍
，將37oC預熱的培養基逐滴加入解凍的細胞。
 
22.支原體汙染、檢測及處理：  
支原體汙染在細胞培養中最常見、不(bu)易(yi)被(bei)查(zha)覺(jiao)
，但(dan)支(zhi)原(yuan)體(ti)汙(wu)染(ran)可(ke)顯(xian)著(zhu)影(ying)響(xiang)細(xi)胞(bao)功(gong)能(neng)幹(gan)擾(rao)實(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)。支(zhi)原(yuan)體(ti)是(shi)介(jie)於(yu)細(xi)菌(jun)和(he)病(bing)毒(du)之(zhi)間(jian)的(de)目(mu)前(qian)所(suo)知(zhi)能(neng)獨(du)立(li)生(sheng)活(huo)的(de)最(zui)小(xiao)微(wei)生(sheng)物(wu)
，它(ta)無(wu)細(xi)胞(bao)壁(bi)，形(xing)態(tai)呈(cheng)高(gao)度(du)多(duo)形(xing)性(xing)，最(zui)小(xiao)直(zhi)徑(jing)0.2um
，可通過濾器。課題組從國外引進細胞株/係也經常出現支原體的汙染。支原體在汙染細胞後
，它通過影響細胞的DNA
、RNA 的(de)合(he)成(cheng)及(ji)急(ji)速(su)消(xiao)耗(hao)培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)的(de)氨(an)基(ji)酸(suan)來(lai)抑(yi)製(zhi)細(xi)胞(bao)的(de)生(sheng)長(chang)

，並(bing)能(neng)降(jiang)低(di)細(xi)胞(bao)的(de)融(rong)合(he)率(lv)。因(yin)此(ci)，在(zai)運(yun)用(yong)各(ge)種(zhong)細(xi)胞(bao)係(xi)進(jin)行(xing)實(shi)驗(yan)研(yan)究(jiu)時(shi)，首(shou)先(xian)要(yao)證(zheng)明(ming)所(suo)用(yong)細(xi)胞(bao)有(you)無(wu)支(zhi)原(yuan)體(ti)的(de)汙(wu)染(ran)。支(zhi)原(yuan)體(ti)汙(wu)染(ran)後(hou)
，培(pei)養(yang)基(ji)可(ke)不(bu)發(fa)生(sheng)渾(hun)濁(zhuo)，細(xi)胞(bao)病(bing)變(bian)輕(qing)微(wei)或(huo)不(bu)明(ming)顯(xian)，因(yin)此(ci)難(nan)以(yi)發(fa)現(xian)。
目前，支原體檢測的方法有以下幾種。（a）相差顯微鏡觀察
；（b）低張處理地衣紅染色法；  （c）熒光染色法
；（d）酶標法
；  （e）PCR法：這是常用的一種簡便的檢測方法。  此方法靈敏度高，檢測耗時短
，樣品量小（隻需50ul細胞培養用液上清），但引物及製劑費用較高。
支原體汙染的處理：1）丟棄細胞
，培養基及其他培養用試劑 2）重新獲取未汙染細胞，新鮮培養基和試劑。