一、實驗原理

稀(xi)釋(shi)平(ping)板(ban)測(ce)數(shu)是(shi)根(gen)據(ju)微(wei)生(sheng)物(wu)在(zai)高(gao)度(du)稀(xi)釋(shi)條(tiao)件(jian)下(xia)固(gu)體(ti)培(pei)養(yang)基(ji)上(shang)所(suo)形(xing)成(cheng)的(de)單(dan)個(ge)菌(jun)落(luo)是(shi)由(you)一(yi)個(ge)單(dan)細(xi)胞(bao)繁(fan)殖(zhi)而(er)成(cheng)這(zhe)一(yi)培(pei)養(yang)特(te)征(zheng)設(she)計(ji)的(de)計(ji)數(shu)方(fang)法(fa)，即(ji)一(yi)個(ge)菌(jun)落(luo)代(dai)表(biao)一(yi)個(ge)單(dan)細(xi)胞(bao)。計(ji)數(shu)時(shi)，首(shou)先(xian)將(jiang)待(dai)測(ce)樣(yang)品(pin)製(zhi)成(cheng)均(jun)勻(yun)的(de)繁(fan)殖(zhi)稀(xi)釋(shi)液(ye)，盡(jin)量(liang)使(shi)樣(yang)品(pin)中(zhong)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)細(xi)胞(bao)分(fen)散(san)開(kai)，使(shi)其(qi)成(cheng)單(dan)個(ge)細(xi)胞(bao)存(cun)在(zai)

，否(fou)則(ze)一(yi)個(ge)菌(jun)落(luo)就(jiu)不(bu)隻(zhi)是(shi)代(dai)表(biao)一(yi)個(ge)細(xi)胞(bao)，再(zai)取(qu)一(yi)定(ding)稀(xi)釋(shi)度(du)、一yi定ding量liang的de稀xi釋shi液ye接jie種zhong到dao平ping板ban中zhong，使shi其qi均jun勻yun分fen布bu於yu平ping板ban中zhong的de培pei養yang基ji內nei。經jing培pei養yang後hou，由you單dan個ge細xi胞bao生sheng長chang繁fan殖zhi形xing成cheng菌jun落luo

，統tong計ji菌jun落luo數shu目mu，即ji可ke計ji算suan出chu樣yang品pin中zhong的de含han菌jun數shu。此ci記ji數shu方fang法fa所suo計ji算suan的de菌jun數shu是shi培pei養yang基ji上shang長chang出chu來lai的de菌jun落luo數shu，故gu又you稱cheng活huo菌jun計ji數shu。一yi般ban用yong於yu某mou些xie產chan品pin檢jian定ding
，如ru根gen瘤liu菌jun劑ji等deng產chan品pin檢jian定ding，生sheng物wu製zhi品pin檢jian驗yan，土tu壤rang含han菌jun量liang測ce定ding及ji食shi品pin
、水源的汙染程度的檢驗。

自zi然ran條tiao件jian下xia

，微wei生sheng物wu常chang以yi群qun落luo狀zhuang態tai存cun在zai，這zhe種zhong群qun落luo往wang往wang是shi不bu同tong種zhong類lei微wei生sheng物wu的de混hun合he體ti。為wei了le研yan究jiu某mou種zhong微wei生sheng物wu的de特te性xing或huo者zhe要yao大da量liang培pei養yang和he使shi用yong某mou種zhong微wei生sheng物wu，必bi須xu從cong這zhe些xie混hun雜za的de微wei生sheng物wu群qun落luo中zhong獲huo得de純chun培pei養yang，這zhe種zhong獲huo得de純chun培pei養yang的de方fang法fa稱cheng為wei微wei生sheng物wu的de分fen離li與yu純chun化hua。

在(zai)自(zi)然(ran)界(jie)中(zhong)，土(tu)壤(rang)是(shi)微(wei)生(sheng)物(wu)生(sheng)活(huo)的(de)良(liang)好(hao)環(huan)境(jing)，其(qi)中(zhong)生(sheng)活(huo)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)數(shu)量(liang)和(he)種(zhong)類(lei)都(dou)是(shi)極(ji)其(qi)豐(feng)富(fu)的(de)，因(yin)此(ci)土(tu)壤(rang)是(shi)人(ren)類(lei)開(kai)發(fa)利(li)用(yong)微(wei)生(sheng)物(wu)資(zi)源(yuan)的(de)重(zhong)要(yao)基(ji)地(di)。土(tu)壤(rang)中(zhong)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)數(shu)量(liang)、種類與土壤肥力有關，肥沃的土壤中多，貧瘠土壤中少。其生理類群則與土壤的其它理化性質，如通氣
、pH有關
，例如在通氣良好的菜園土中
，好氣性微生物占有絕對優勢。本實驗以菜園土為材料分離土壤中的好氣性細菌，並進行數量測定。

分離微生物時
，一般是根據該微生物對營養
、pH、yangqidengyaoqiudebutong，gonggeitamenshiyideshenghuotiaojian，huojiarumouzhongyizhijizaochengzhiliyugaijunzhongshengchang，buliyuqitajunzhongshengchangdehuanjing，congertaotaibuxuyaodejunzhong。fenliweishengwuchangyongdefangfayouxishipingbanfenlifahehuaxianfenlifa，genjubutongdecailiao，keyicaiyongbutongfangfa，qizuizhongmudeshiyaozaipeiyangjishangchuxianyufenliweishengwudedangejunluo
，biyaoshizaiduidangejunluojinyibufenlichunhua。zaiyongxishipingbanfenliweishengwushi，haikeyitongshicedingdaifenlideweishengwudeshuliang。

放線菌與細菌同屬原核微生物
，是重要的抗生素產生菌，在土壤中的數量僅次於細菌，尤其是在有機質豐富、透氣性好的中性到微堿性土壤中的數量較多。本實驗采用高氏一號瓊脂培養基分離和計數菜園土中的放線菌。

真菌在土壤中的數量次於細菌和放線菌，主要在有機質豐富
、透tou氣qi性xing好hao的de偏pian酸suan性xing土tu壤rang中zhong較jiao多duo。分fen離li土tu壤rang中zhong的de真zhen菌jun並bing不bu難nan
，但dan由you於yu其qi菌jun落luo大da，容rong易yi擴kuo展zhan，計ji數shu準zhun確que性xing較jiao低di。本ben實shi驗yan采cai用yong加jia有you氯lv黴mei素su或huo慶qing大da黴mei素su和he孟meng加jia拉la紅hong的de馬ma丁ding氏shi培pei養yang基ji分fen離li及ji計ji數shu菜cai園yuan土tu中zhong的de真zhen菌jun。按an一yi般ban資zi料liao介jie紹shao為wei鏈lian黴mei素su，但dan此ci種zhong抗kang生sheng素su要yao先xian配pei成cheng一yi定ding濃nong度du的de溶rong液ye
，且qie應ying於yu倒dao平ping板ban前qian才cai加jia入ru培pei養yang基ji中zhong。在zai此ci培pei養yang基ji上shang，放fang線xian菌jun和he細xi菌jun被bei氯lv黴mei素su或huo慶qing大da黴mei素su和he孟meng加jia拉la紅hong所suo抑yi製zhi
，但dan大da多duo數shu真zhen菌jun能neng夠gou生sheng存cun
，且qie其qi菌jun落luo受shou孟meng加jia拉la紅hong的de抑yi製zhi而er較jiao小xiao
，從cong而er避bi免mian了le某mou些xie真zhen菌jun的de擴kuo散san蔓man延yan而er帶dai來lai的de數shu量liang上shang的de誤wu差cha。

二、實驗材料

1、活材料：蘇雲金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）菌劑。

2、培養基：牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基；高氏一號瓊脂培養基

；加有氯黴素（或慶大黴素）和孟加拉紅的馬丁氏瓊脂培養基:在1000mL培養基中加入注射用氯黴素2mL，孟加拉紅33.4mg，均於滅菌前加入。

3、材料：肥沃茶園土。

實驗用品

內裝15～20個玻璃珠的90mL無菌水、9mL無菌水、直徑9cm的無菌平皿、1mL無菌吸管、天平、稱樣瓶
、記號筆
、玻璃刮鏟、經2mm土壤篩過篩的菜園、天平、試管架、無菌稱量紙、酒精燈、火柴
、接種環、無菌水。

三、實驗方法

（一）稀釋平板測數法

1、樣品稀釋液的製備

準確稱取待測樣品10g
，放入裝有90mL無菌水並放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置搖床上振蕩20min
，使微生物細胞分散，靜置20～30s

，即成10－1稀釋液；再用1mL無菌吸管，吸取10－1稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次

，讓菌液混合均勻，即成10－2稀釋液；再換一支無菌吸管，吸取10－2稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中

，也吹吸3次，即成10－3稀釋液；以此類推，連續稀釋
，製成10－4
、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9等一係列稀釋菌液。

用(yong)稀(xi)釋(shi)平(ping)板(ban)計(ji)數(shu)時(shi)
，待(dai)測(ce)菌(jun)稀(xi)釋(shi)度(du)的(de)選(xuan)擇(ze)應(ying)根(gen)據(ju)樣(yang)品(pin)確(que)定(ding)。樣(yang)品(pin)中(zhong)所(suo)含(han)待(dai)測(ce)菌(jun)的(de)數(shu)量(liang)多(duo)時(shi)，稀(xi)釋(shi)度(du)應(ying)高(gao)，反(fan)之(zhi)則(ze)低(di)。通(tong)常(chang)測(ce)定(ding)細(xi)菌(jun)菌(jun)劑(ji)含(han)菌(jun)數(shu)時(shi)，采(cai)用(yong)10－7、10－8
、10－9稀釋度，測定土壤細菌數量時，采用10－4
、10－5
、10－6稀釋度，測定放線菌數量時，采用10－3、10－4、10－5稀釋度
，測定真菌數量時，采用10－2
、10－3、10－4稀釋度。

2、平板接種培養

平板接種培養有混合平板培養法和塗抹平板培養法兩種方法。

⑴混合平板培養法

將無菌平板編上10－7、10－8
、10－9號碼，每一號碼設置三個重複，用無菌吸管按無菌操作要求吸取1×10－9稀釋液各1mL放入編號10－9的3個平板中，同法吸取10－8稀釋液各1mL放入編號1×10－8的3個平板中
，再吸取1×10－7稀釋液各1mL放入編號1×10－7的3個平板中
，由低濃度向高濃度時，吸管可不必更換。然後在9個平板中分別倒入已熔化並冷卻至45～50℃的細菌培養基，輕輕轉動平板，使菌液與培養基混合均勻，冷凝後倒置，在30℃下培養。至菌落長出後即可計數。

⑵塗抹平板計數法

塗抹平板計數法與混合法基本相同，所不同的是先將培養基熔化後趁熱倒入無菌平板中，待凝固後編號，然後用無菌吸管吸取0.1mL菌jun液ye對dui號hao接jie種zhong在zai不bu同tong稀xi釋shi度du編bian號hao的de瓊qiong脂zhi平ping板ban上shang，每mei個ge編bian號hao設she三san個ge重zhong複fu。再zai用yong無wu菌jun刮gua鏟chan將jiang菌jun液ye在zai平ping板ban上shang塗tu抹mo均jun勻yun，每mei個ge稀xi釋shi度du用yong一yi個ge滅mie菌jun刮gua鏟chan
，更geng換huan稀xi釋shi度du時shi需xu將jiang刮gua鏟chan灼zhuo燒shao滅mie菌jun。在zai由you低di濃nong度du向xiang高gao濃nong度du塗tu抹mo時shi，也ye可ke以yi不bu更geng換huan刮gua鏟chan。將jiang塗tu抹mo好hao的de平ping板ban平ping放fang於yu桌zhuo上shang20～30min
，使菌液滲透入培養基內，然後將平板倒轉，保溫培養
，至菌落長出後即可計數。

（二）土壤中好氣性細菌的分離與計數

1、土壤稀釋液的製備

按“稀釋平板測數法”的相同步驟進行
，按無菌操作法將土壤稀釋至10－6即可。

2、分離方法

可以用三種方法進行分離。

⑴混菌法：按“稀釋平板測數法”中的“混合平板培養法”進行，使用的稀釋度為10－4、10－4
、10－6三個
，各做3個重複。

⑵塗抹法：按“稀釋平板測數法”中的“塗抹平板測數法”進行，使用的稀釋度為10－3、10－4、10－5三個，各做3個重複。

以上兩法又統稱為稀釋平板分離法，可同時用於所分離菌的計數。

⑶劃線法：用滅菌接種環沾取10-1稀釋液1環於已凝固的平板上進行劃線（圖示）。劃線可按以下兩種方式進行
，一種為交叉劃線法，是在平板的一邊做第一次“Z”字形劃線。轉動培養皿70°角

，將接種環在火上燒過並冷卻後，通過第一次劃線部分
，做第二次“Z”字形劃線。同法進行第三次、第四次劃線。另一種為邊疆劃線法，是從平板邊緣的一點開始，連續作緊密的波浪式劃線，直至平板中央。轉動培養皿180°

，再從平板另一邊（不燒接種環）同樣劃線至平板中央。劃線法實質上屬於一種“由點到線”的稀釋法，較適用於含菌比較單一的材料的純化，對於土壤這類微生物高度混雜的樣品則較少使用。

以上各種分離法
，都應按無菌操作進行。所用的培養基若在倒平板前，按50μg/m L 的量加入用乙醇溶解的製黴菌素或放線菌酮（起抑製黴菌的作用），效果會更好。

3、培養

將上述接種過土壤懸液的平板倒置，於28～30℃培養

，至長出菌落為止（24～36h）。

4、挑菌純化

在zai平ping板ban上shang選xuan擇ze分fen離li較jiao好hao的de有you代dai表biao性xing的de單dan菌jun落luo接jie種zhong斜xie麵mian
，同tong時shi作zuo塗tu片pian檢jian查zha，若ruo發fa現xian不bu純chun，應ying挑tiao取qu此ci菌jun落luo做zuo進jin一yi步bu劃hua線xian分fen離li，或huo製zhi成cheng菌jun懸xuan液ye再zai做zuo稀xi釋shi分fen離li

，直zhi至zhi獲huo得de純chun培pei養yang體ti。

5、計數

選取混菌法和塗抹法中每皿菌落數30～300的平板，分別按“稀釋平板測數法”中的“混合平板測數法”和“塗抹平板測數法”中zhong的de公gong式shi計ji數shu。這zhe樣yang求qiu得de的de是shi每mei克ke原yuan始shi土tu樣yang中zhong的de活huo菌jun數shu

，若ruo要yao折zhe算suan為wei每mei克ke幹gan土tu的de含han菌jun數shu，還hai應ying將jiang此ci數shu值zhi除chu以yi幹gan土tu在zai土tu樣yang中zhong所suo占zhan的de質zhi量liang分fen數shu(烘幹土的質量/原土樣的質量)。

注：土壤含水量的測定是將一定質量的土壤在105～110℃下烘幹至恒重，再稱幹重。

（三）、土壤中放線菌的分離與計數

1、土壤稀釋液的製備

按實驗“稀釋平板計數法”中的方法進行
，將菜園土稀釋至10－5。在稀釋時
，可在盛無菌水的三角瓶中加10滴100g/L的石炭酸溶液和50μg/m L 的製黴菌素以抑製細菌和黴菌的生長。

2、分離方法

采用稀釋平板分離法，又可分為兩種方法。

⑴混菌法：按“稀釋平板計數法”中的“混合平板培養法”進行，所不同者是稀釋度，應采用10－3、10－4、10－5三個稀釋度
，各做3個重複。

⑵塗抹法：按“稀釋平板計數法”中的“塗抹平板計數法”進行，應采用10－2
、10－3、10－4三個稀釋度，各做3個重複。

3、培養

將上述接種過土壤懸液的平板倒置於28～30℃培養4～5d。

4、挑菌純化

從平板中選擇分離較好的放線菌菌落（應與細菌菌落區別開）較接斜麵，並製片作純度檢查，若不純，應進一步將該菌作稀釋平板分離或劃線分離，直至獲得純培養。

（四）
、土壤中真菌的分離純化與計數

1、土壤稀釋液的製備

按實驗“稀釋平板計數法”中的方法進行
，將土樣稀釋至10－4。

2、分離方法

采用稀釋平板分離法。又可分為兩種方法。

⑴混菌法：按“稀釋平板計數法”中的“混合平板培養法”進行，所不同的是稀釋度
，應選10-2、10－3
、10－4三個稀釋度進行接種。

⑵塗抹法：按“稀釋平板計數法”中的“塗抹平板計數法”進行，所不同的是稀釋度

，應選10-1、10－2

、10－3三個稀釋度進行接種。

3、培養

將上述接種土壤懸液的平板倒置於28℃培養3～5d。

4、挑菌純化

從長有單菌落的平板中選取典型的真菌菌落（包括酵母菌菌落）轉zhuan接jie斜xie麵mian
，並bing同tong時shi製zhi片pian作zuo純chun度du檢jian查zha。若ruo不bu純chun，應ying進jin一yi步bu挑tiao取qu該gai菌jun落luo采cai用yong劃hua線xian分fen離li
，或huo製zhi成cheng菌jun懸xuan液ye進jin一yi步bu作zuo稀xi釋shi分fen離li，直zhi至zhi獲huo得de純chun培pei養yang體ti為wei止zhi。

5、計數

選取每皿菌落數在10～100之間的平板用於計數。不應遺漏酵母菌的菌落，必要時可製片檢查，以免誤為細菌菌落，具體方法見土壤中好氣性細菌的分離與計數。

6、菌種保存

將分離到的真菌轉接到PDA斜麵上培養，待長好後，置於冰籍中保存
，必要時進行深入研究。